基于桿狀病毒F蛋白的真核表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、表面展示技術(shù)為生物大分子的設(shè)計以及分析它們之間的相互作用提供了有力的工具。近十幾年來，噬菌體表面展示已被應(yīng)用分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域并極大的促進了生物學(xué)的研究進展。但是作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在糖基化，復(fù)雜蛋白質(zhì)的折疊方面，噬菌體表面展示技術(shù)顯示出一定的局限性。真核展示使得復(fù)雜糖基化蛋白的表達(dá)成為可能。自從1995年Boublik等以苜蓿銀紋夜蛾多核衣殼核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleoca

2、psidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)成功展示外源蛋白以來，已經(jīng)有多個實驗室利用該系統(tǒng)展示了一系列原核系統(tǒng)難以展示的蛋白。通常是將外源蛋白融合到AcMNPV的主要膜蛋白Gp64的N末端。該技術(shù)在產(chǎn)生和篩選真核表達(dá)文庫以及生產(chǎn)單克隆抗體中的潛在應(yīng)用價值已經(jīng)得到驗證。 桿狀病毒的出芽型病毒粒子(buddedvirions，BV)有兩類截然不同的膜融合蛋白。Gp64是組Ⅰ類NPVBV上的主要膜融合蛋白，它在低

3、pH的條件下介導(dǎo)膜融合；并且Gp64對于病毒粒子從被感染細(xì)胞中的出芽是必需的。另一類不同的膜蛋白由組Ⅱ類NPV編碼，被稱為F蛋白。組Ⅱ類NPV包括甜菜夜蛾核多角體病毒(SpodopteraexiguaMNPV，SeMNPV)，舞毒夜蛾核多角體病毒(LymantriadisperMNPV，LdMNPV)，中國棉鈴蟲核多角體病毒(HelicoverpaarmigeraSNPV,HaSNPV)等。作為Gp64的同源蛋白，F(xiàn)蛋白同樣在病毒進入細(xì)

4、胞的過程中介導(dǎo)酸性條件下的膜融合。但是F蛋白在獲得膜融合活性并使病毒粒子有感染性之前，必需要被細(xì)胞內(nèi)的furin蛋白酶切割成兩個二硫鍵連接的小亞基。到目前為止，基于AcMNPV和基于BmNPV(BombyxmoriNPV)的桿狀病毒表面展示系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)出來。但它們都是屬于組Ⅰ類NPV，組Ⅱ類NPV的表面展示還沒有人研究。在本文中，我們將報告另一類基于HaSNPV的F蛋白的真核展示系統(tǒng)得構(gòu)建。 HaSNPV是棉鈴蟲的主要致病病毒，

5、所以在中國主要用于生物防治殺蟲劑。像其他的組Ⅱ類NPV一樣，HaSNPV的基因中沒有Gp64樣的基因，但是發(fā)現(xiàn)ORF133與f基因同源，經(jīng)研究證實ha133編碼F蛋白。F蛋白經(jīng)過翻譯后修飾被切割成兩個由二硫鍵連接的小亞基，一個是跨膜結(jié)構(gòu)域所在的F1片段，大小59kd，另一個是20kd的F2片段。由于F蛋白介導(dǎo)病毒粒子進入細(xì)胞的過程并能影響病毒粒子出芽的效率，因而在病毒的復(fù)制周期中是必需的，它的缺失也是致死的，所以我們在HaSNPV基因組

6、的polh基因座處引入F蛋白的第二個基因拷貝。作為組Ⅱ類的桿i狀病毒表面展示技術(shù)的模式系統(tǒng)，我們在f基因上找到兩個位點，將報告基因GST(編碼26kd的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)插入其中，構(gòu)建了兩個轉(zhuǎn)移載體(pFBDeGFP-GSTha133-Ⅰ和pFBDeGFP-GSTha133-Ⅱ)。通過HaSNPVBac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)造了含有F嵌合蛋白的兩個重組HaBacmid(Ha-GSTha133-Ⅰ與Ha-GSTha133-Ⅱ)，其中一個(H