重組大流行流感滅活疫苗(家蠶桿狀病毒)的檢定.pdf

1、重組大流行流感疫苗(家蠶桿狀病毒)是一種新型的基因工程禽流感疫苗。該疫苗是利用家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù),將高致病性禽流感病毒A/Zhejiang/1/16/06(H5N1)株表面HA膜蛋白基因高效表達(dá)并將重組產(chǎn)物展示在家蠶桿狀病毒的囊膜表面,形成表面攜帶HA胞外結(jié)構(gòu)域的重組家蠶桿狀病毒。該重組病毒經(jīng)分離、純化、滅活后制成禽流感疫苗,免疫實(shí)驗(yàn)動物后,能夠產(chǎn)生有效的中和抗體,在Balb/c小鼠、新西蘭大白兔、恒河猴動物試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)具有良好

2、的安全性及免疫效果。因此,有望將該疫苗推向臨床試驗(yàn)。該創(chuàng)新疫苗由于沒有現(xiàn)成的國家標(biāo)準(zhǔn),需要根據(jù)實(shí)際情況自行制定合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)SFDA關(guān)于新生物制品生產(chǎn)規(guī)范的相關(guān)要求,對該疫苗進(jìn)行了檢定,為制定合適的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提供參考。
　　 我們將疫苗毒種Bmgp64HA在家蠶BmN細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)30代,并提取各代病毒的基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。以融合基因上下游序列設(shè)計(jì)GP1和GP2—對引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1-10代

3、病毒基因組的PCR結(jié)果均為陽性。DNA序列測定結(jié)果表明1-10代的病毒基因組中均含有完整的插入序列(GP-HA),與初始的GP-HA序列比對后未出現(xiàn)突變,可作為疫苗毒種工作種子批選定的參考。疫苗總蛋白的胰酶酶解樣品經(jīng)MALDI-TOF-MS進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜分析,通過高通量的肽質(zhì)量指紋圖譜對蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與HA蛋白序列匹配的肽段有7條,序列覆蓋率為24％,這證明疫苗中含有HA蛋白,但是完成疫苗中HA全序列的鑒定還需要近一步的研究

4、。血凝試驗(yàn)表明重組大流行流感疫苗(家蠶桿狀病毒)表面的HA蛋白具有活性,可以發(fā)生血凝反應(yīng),血凝滴度達(dá)1:16。用HA特異性抗體對疫苗樣品進(jìn)行Western Blotting鑒定,結(jié)果出現(xiàn)3個條帶。這與疫苗中的HA蛋白有HA、HA1和HA2這3種存在形式的預(yù)期相符。我們嘗試用SRID法、DOT-BLOT法和間接ELISA法測定疫苗中HA的含量。在本研究中,SRID法和:DOT-BLOT、法不能測定該疫苗中的HA含量,間接ELISA法測得的