鵝源呼腸孤病毒油乳劑滅活疫苗的制備.pdf

1、鵝呼腸孤病毒?。╣oosereovirus,GRV）是由鵝呼腸孤病毒引起的一種傳染病，近年來該病在我國多個省份流行發(fā)生，給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經濟損失，極大的危害了我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。
　　2015年下半年江蘇省某鵝場的鵝群發(fā)生了一種以肝脾壞死、運動障礙為主要特征的傳染病，疑似感染呼腸孤病毒。為探明該病病原，本研究將病死鵝的組織勻漿液，卵黃囊接種10日齡鵝胚，從尿囊液中分離到一株病毒，病毒分離株對雞紅細胞沒有血凝活性，其ELD50

2、為10-3.75/0.2 mL。參考GenBank鵝呼腸孤病毒基因序列的保守區(qū)設計合成了特異性引物，用該引物對提取的病毒RNA進行RT-PCR，可擴增到約380bp目的條帶，將目的條帶回收后和pMD18-T載體連接，將重組載體轉化到DH5α大腸桿菌并在AMP＋/LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對陽性菌落測序分析。結果表明，克隆的基因片段為鵝呼腸孤病毒σC基因片段；用生物學軟件分析該分離株與水禽源呼腸孤病毒存在于同一分支，同源性在94.8％~96.5%

3、，與雞呼腸孤病毒同源性僅39.9%~50.5%；在6日齡的雛鵝上進行回歸實驗可復制該病；上述結果表明該分離株為鵝呼腸孤病毒，分離的病毒由實驗室保存。
　　將保存的鵝呼腸孤病毒分離株經鵝胚傳代三次，收獲病毒尿囊液，8000 rp m離心15min，取上清，加雙抗。將10號白油，Spa n-80和硬脂酸鋁按一定比例混合作油相，經雙抗處理的病毒液加2%的吐溫-80制作水相，按照油水比2：1混合制備油乳劑滅活疫苗，并進行包括外觀、乳劑類型

4、、粘度、穩(wěn)定性、無菌、安全性和保存期的質量檢驗。為評價制備的滅活疫苗的免疫效力，將90只6日齡的雛鵝隨機分為3組，每組30只，1-2組為免疫組，免疫劑量分別為0.2 mL和0.5 mL，第3組為對照組，免疫后進行抗體水平監(jiān)測和免疫保護試驗，并觀察試驗鵝的發(fā)病和死亡情況。結果表明疫苗外觀為乳白色，呈油包水型，無菌，粘度符合標準，穩(wěn)定性良好，對動物無不良反應，4℃下可保存12個月以上；免疫保護試驗中，免疫組攻毒后出現短暫的精神沉郁，1組在在

5、免疫兩周時仍不能完全保護雛鵝，2組免疫一周后即可完全保護，對照組攻毒后雛鵝均出現典型的病理變化并死亡；1組攻毒鵝泄殖腔拭子于第3天開始檢測到病毒核酸，第12天時仍有部分樣品檢測核酸為陽性，2組檢測病毒核酸為陰性；對免疫后雛鵝血液中的抗體監(jiān)測，免疫后6d抗體開始明顯上升，20d左右達到峰值，此后稍有降低但仍可維持高峰2周以上。上述結果表明制備的鵝呼腸孤病毒滅活疫苗安全、穩(wěn)定、易于儲存運輸，雛鵝免疫后能獲得堅強保護力，抗體水平能維持高峰數周