呼腸孤病毒的結構研究【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　呼腸孤病毒的結構研究</p><p><b>　　摘要：</b></p><p>　　哺乳動物的呼腸孤病毒作為一個研究病毒性發(fā)病機制并且容易加工處理的模型系

2、統(tǒng)，呼腸孤病毒幾乎可以感染所有的哺乳動物，但是只能在比較年幼的個體中發(fā)病。三株呼腸孤病毒的原型株在被感染的新生小鼠中的發(fā)病機理各不相同。呼腸孤病毒被不完全封閉的二十面體結構顆粒包圍，這些顆粒包括了由兩個蛋白質外殼包裹著的十段雙螺旋RNA核心片段。呼腸孤病毒的外層衣殼和一個受體接收器的高分辨率結構都已經(jīng)探明,這些結構在病毒吸附、注入和發(fā)病機制中為這些分子的功能提供了深入的了解。呼腸孤病毒與靶細胞的黏著是以σ1蛋白為介導，這種蛋白表是表達在

3、病毒外層衣殼的纖維狀三聚體。交叉黏著的A分子是呼腸孤病毒的血清自由型受體，唾液酸是這三種菌株的共同受體。與細胞表面的受體結合后，呼腸孤病毒通過受體介導的內吞作用進入細胞。病毒的內在化隨著外層衣殼在內吞作用中的逐步拆卸而不斷進行。病毒的脫殼，需要酸性的PH和內吞作用的酶使得外層衣殼的σ3蛋白脫去，導致以µ1為中介的膜通透性的升高和黏著物σ1蛋白構象的改變。沒有外殼包裹著的病毒遺傳物質進入了細胞質，即細胞復制進行的場所。盡管呼腸孤

4、病毒的黏著和進入宿主細胞機制的研究上有了重大的進步,但是許多</p><p>　　關鍵詞：呼腸孤病毒；靶細胞；基因組</p><p><b>　　1、介紹</b></p><p>　　哺乳動物的肝腦脊髓炎病毒（這里稱為呼腸孤病毒）作為研究病毒的發(fā)病機制是一種比較理想的模型。呼腸孤病毒是沒有全部被包圍的二十面體狀病毒。該病毒含有十條雙鏈RNA片段

5、的病毒基因組。有三種呼腸孤病毒血清型，可以根據(jù)呼腸孤病毒抗血清能力和在凝聚紅血球中病毒感染的能力而區(qū)別。這三個血清型是每個感染的個體中分離出的原型株：1型（T1L），2型（T2J），3型（T3D）。呼腸孤病毒地理分布廣泛，而且?guī)缀踉谒械牟溉閯游矬w內都存在，包括人類都作為這種病毒的感染宿主[1]。然而，呼腸孤病毒病能夠引起疾病，但是只發(fā)生在幼小的個體中[2，3]。</p><p>　　新生小鼠對于呼腸孤病毒的感染

6、很敏感，并已成為研究呼腸孤病毒病理成因[4]的首選模型。使用口服或肌肉注射的方法對新生小鼠接種，對1型和3型呼腸孤病毒株入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同路線和病理結果的觀察，3型呼腸孤病毒進入哺乳動物的細胞方式不同，產(chǎn)生的病理學結果也不同。1型呼腸孤病毒擴散到造血性中樞神經(jīng)系統(tǒng)并且可感染室管膜細胞[5，6]，產(chǎn)生腦膜炎[7]。相比之下，3型呼腸孤病毒傳播途徑和感染的神經(jīng)細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成致命的腦炎。研究使用T1L x T3D重配病毒表明，病毒

7、傳播的途徑和其神經(jīng)組織嗜性[8，9]與病毒S1基因有關，這種基因可以編碼附著蛋白σ1[10]。 T1L x T3D重配病毒也被用來證明病毒結合的室管膜基元細胞是隨著各種病毒血清型的S1基因表達產(chǎn)物的差異而不同。這些研究表明，σ1蛋白決定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)類型的細胞。</p><p>　　呼腸孤病毒感染目標這一特征，大概是其與中樞神經(jīng)細胞特異性表達的受體結合的能力有關。呼腸孤病毒受體的介導除賦予病毒的附著外，也誘導加強

8、病毒發(fā)病能力。培養(yǎng)的細胞和體內的細胞中呼腸孤病毒誘導這些細胞凋亡。應變T3D比T1L在更大程度上比株小鼠的L929細胞、狗腎細胞和人類HeLa細胞更能誘導細胞凋亡。這些菌株誘導細胞凋亡能力的不同，主要是是由S1基因的克隆決定，表明了受體與細胞凋亡信號的作用。然而,病毒拆卸的步驟,發(fā)生在細胞黏著之后，同樣需要呼腸孤病毒介導的細胞凋亡。</p><p>　　為了附著宿主細胞，呼腸孤病毒顆粒必須穿透細胞膜和激活病毒的轉

9、錄機制。這種受體介導的內吞作用機制，宿主細胞存在于蛋白酶內吞途徑中，這種途徑是一種逐步拆卸需要脫去外層衣殼的過程。內吞作用中該σ3蛋白被蛋白酶水解，μ1蛋白發(fā)生構象的變化，有利于提高膜的最大滲透率，使得病毒顆粒的進入。</p><p>　　在這里，下面是呼腸孤病毒附著和進入細胞的審查機制。研究呼腸孤病毒復制的技術已經(jīng)有所提高?？衫貌《就鈱右職さ鞍椎母叻直媛式Y構和至少一個病毒受體來完成這項工作，加上呼腸孤病毒附著

10、和進入過程的遺傳分析，使得病毒的蛋白質結構與功能以及病毒病之間的關系增進了解。</p><p>　　2 呼腸孤病毒的結構與功能附著蛋白σ1</p><p>　　2．1 σ1三聚體的結構</p><p>　　呼腸孤病毒粒子直徑約850 Å。十個片段的雙鏈RNA呼腸病毒基因組的組成范圍內由兩個同心蛋白質外殼，外層衣殼和內部的核心組成，外層衣殼和核心是由8個結

11、構蛋白組成。μ1和σ3蛋白組成了緊密相關的大容量外層衣殼。此外，還有12個五面體組成的二十面體，其中每個頂點由λ2蛋白形成。</p><p>　　該σ1蛋白是一種纖維狀、約480 Å的具有鮮明的頭部和尾部形態(tài)[11，12]（圖1）長度三聚體分子。不連續(xù)的區(qū)域分子結合細胞表面的受體。序列中N -端結合碳水化合物σ1尾巴，這是已知的唾液酸與α2，3或α2，6 3型呼腸孤病毒之間的聯(lián)系。C端σ1頭交界粘附分子

12、結合A型（JAM-A，以前稱為JAM1）。σ1尾部的部分插入到病毒，而頭部分遠離病毒的表面。插入的三聚體σ1蛋白進入一個五元體λ2基部，結果表現(xiàn)出對稱性。這種不對稱性往往產(chǎn)生有限的相互作用或特異性，引導分子進行結構性的重排。（圖1）圖1.呼腸孤病毒σ1結構。左：計算機處理的電子顯微照片σ1顯示的是靈活性和近似的分子尺寸的地區(qū)。圖像來自Fraser等地區(qū)[11]。右：呼腸孤病毒σ1的長度模型，加入β-螺旋重復，由三聚體形成的卷曲伸長后成為

13、螺旋線圈結構[156]，到N -端σ1結晶片段為主。分子之間相互作用和JAM-A和唾液酸用近似分子尺寸表示。這個模型使用絲帶狀物表示。</p><p>　　對C末端結構分析，T3D（殘基246-455）顯示一半是三聚體σ1結構，其中的每個單元包括一個細長的尾巴和緊湊的頭部[31]（圖2）。這個C -末端殘基形成了兩個希臘鑰匙結構的β-螺旋頭部域。循環(huán)連接的β-螺旋是短期與前循環(huán)連接310螺旋的β-轉角（圖2）。在

14、結晶片段N端殘基組成分了三個β-螺旋重復組成的部尾。每個螺旋是由β-螺旋和β-轉角連接的非脯氨酸或在其第三位甘氨酸連接的殘基[13]組成。該σ1三聚體具有獨特彎曲的頭部之間的三重軸部和尾部結構域。雖然這可能引入彎曲力，但是它表明σ1三聚體具有高度的靈活性。位于第二和第三個β-螺旋重復的尾巴區(qū)域并對應于一個四殘基的插入的氨基酸之間具有很大的靈活性（圖2）。</p><p>　　序列分析使得一個全部σ1模型的發(fā)現(xiàn)。該

15、σ1尾巴被認為含有一個N 端α-螺旋并具β-螺旋重復的序列組成（圖1）。序列的預測形成α-螺旋卷曲所需要的三聚體的穩(wěn)定性。σ1全長電子顯微鏡（EM）的圖像在三個區(qū)域表現(xiàn)出分子的靈活性，近的N -末端區(qū)域，一個區(qū)域與從預測的α-螺旋卷曲線圈過渡到三β-螺旋相關，另一個區(qū)域，對應于β-螺旋插入和結晶部分的T3Dσ13（圖1）。這些區(qū)域可以與受體相互作用或使病毒在裝配或拆卸中重排。</p><p><b>　

16、?。▓D2）</b></p><p>　　圖2 A ，C呼腸孤病毒σ1的晶體結構。作者使用紅色、橙色、藍色絲帶狀物繪出σ1三聚體與單體，并blue.每個帶狀物包括一個緊湊的β-螺旋和一個有三個β-螺旋重復纖維的尾巴。乙擴大鑒于σ1頭域單體。這兩個希臘鍵圖案，顯示為紅色和橙色，formacompact，圓柱β-折疊，包含八個β-鏈（一- H）的。該頭域還包含兩個短螺旋，以藍色顯示：310和一個α-螺旋。&

17、#231;示意圖中的σ1頭域的β-鏈的結構。</p><p>　　2.2 σ1與唾液酸的相互作用</p><p>　　呼腸孤病毒表現(xiàn)出粘合多種哺乳動物紅細胞[14]的能力。對于3型呼腸孤病毒，血凝是σ1蛋白與唾液酸殘基的相互作用，是由紅細胞血型糖蛋白糖基化蛋白A所介導的[15]。 呼腸孤病毒血清型對其他受體的碳水化合物并沒有較好黏著的特點。唾液酸結合需要呼腸病毒的附著和某些細胞類型，包括小

18、鼠紅白血病（MEL）的感染細胞[16]。雖然并非所有的血清型3菌株是結合唾液酸的，大部分碳水化合物結合而產(chǎn)生紅血球凝聚。此外，非唾液酸結合血清3型變種可以適應在MEL細胞中連續(xù)傳代。在一個離散的區(qū)域這些變種已獲得結合唾液酸和使得σ1序列變化的能力，在這附近殘留可能形成一個唾液酸結合位點[17]的一部分，可以用實驗來加以表達。</p><p>　　1型呼腸孤病毒似乎也在某些情況下可以結合唾液酸。對兔Peye組織切片

19、研究顯示：連接可以被神經(jīng)氨酸酶或與組織切片孵育所專門識別的凝集素α2-3連接的唾液酸抑制。對T1L綁定到M細胞的頂面的能力證明與隔離使用的S1基因重配涂上遺傳學和呼腸病毒顆粒σ1重組蛋白。 T1Lσ1和唾液酸之間的相互作用尤其是復雜的，1型呼腸孤病毒感染MEL細胞依賴于唾液酸。</p><p>　　2.3 與JAM-A的聯(lián)系</p><p>　　積累了大量的證據(jù)表明，σ1頭部結合細胞表面

20、的受體[18]。使用T3D中和抗體9BG5從遺傳學角度上能改變σ1頭部的趨向。這一發(fā)現(xiàn)表明，截斷的σ1頭部具有特定的相互作用的能力。一般地， T3D病毒蛋白質水解酶釋放的C -末端受體結合的σ1片段最終導致呼腸孤病毒感染失效。這些結果表明，σ1頭部促進受體相互作用，這與唾液酸介導的σ1尾部作用不同的。</p><p>　　3 JAM-A 胞外域的結構</p><p>　　呼腸孤病毒受體JA

21、M-A作為閉鎖小帶或形成內皮細胞和上皮細胞之間的緊密連接[19]是被稱為屏障的重要組成部分。緊密連接在細胞間的水和溶質運輸中構成一個半滲透屏障，有助于建立上皮細胞頂部和基底，并作為囊泡和信號定位[20]的臨界點。緊密連接包括復雜的相互作用的纖維網(wǎng)絡，作用于上皮細胞部分和胞間的縫隙。緊密連接的封閉蛋白和水閘蛋白都集中在纖維網(wǎng)絡中使得緊密連接更加具有封閉性。JAM-A與多種蛋白質相互作用，JAM-A外域與白細胞功能相關抗原-1（LFA的-

22、1,整合αLβ2）相互聯(lián)系。眾所周知，細胞內蛋白質結合緊密連接的組件，包括閉鎖小帶和多融合蛋白結構域1（MUPP1）和分區(qū)缺陷的蛋白質。在整個炎癥的過程中，JAM-A的出現(xiàn)會影響白細胞在內皮細胞和上皮細胞的遷移，雖然這種機制至今不明原因。 </p><p>　　呼腸孤病毒通過JAM-A介導的緊密連接可能對呼腸病毒感染的發(fā)病機制有著重大的作用。呼腸孤病毒通過M細胞進入腸細胞的基底表面[21]，這將使病毒到達JAM-

23、A表達的最高地區(qū)。緊密連接構成的障礙的短暫的破壞，如免疫細胞的遷移過程中使得呼腸病毒腸的內腔進入JAM-A。除了呼腸孤病毒，在細胞與細胞接觸區(qū)域的其他一些病毒也結合 受體。像JAM-A中、柯薩奇病毒和腺病毒受體都是表達在緊密連接處，而作為單純皰疹病毒的受體，均以表達在粘著連接處[22]。有趣的是，這些病毒能夠感染上皮細胞和某些神經(jīng)元的表面。JAM-A與呼腸孤病毒的相互作用可能提高病毒的脫落和傳輸,導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內皮細胞緊密連接的不

24、穩(wěn)定，有可能擊穿血腦屏障引起腦水腫和神經(jīng)炎癥。</p><p><b>　　（圖3A-C） </b></p><p>　　圖3A-C hJAM-A胞外結構域的晶體結構。A、B端段的圖是hJAM-A二聚體，一個是橙色的單體，連一個是藍色的單體。圖中畫出了兩條正交直線。綠色的是二硫鍵。C圖是兩個hJAM-A分子相互作用區(qū)域圖。膜末端區(qū)域的物質形成了GFCC的表面。這幅

25、圖顯示了結晶雙氫鍵和鹽橋圓柱體結構。氨基酸類別用單字符號標志。顯示對應的拉丁字符的拼音</p><p>　　JAM-A是黏著蛋白家族的一員，與JAM-A最相關的就是JAM-B (JAM2)和JAM-C (JAM3)，其中分別有44％和32％的氨基酸與JAM-A相同。每個蛋白質分別包括細胞外免疫球蛋白樣結構域，一個短跨膜區(qū)和一個尾部細胞質含有融合蛋白的結合結構域。人類和小鼠的JAM-A晶體結構同源（圖3），都作為呼

26、腸孤病毒的受體。不像JAM-A, JAM-B和JAM-C，JAM-A 晶體作為膜端結構域（圖3A）。這種二聚體結構是由一個極不尋常的接口所維持，里面含有許多殘留物。JAM-A的四個鹽橋位于中心接口。Arg59和Glu61與Lys63和Glu121的側鏈的相互作用力相互中和。蛋白與蛋白的相互作用力被疏水殘基或極性殘基所介導，使帶電氨基酸在溶劑中發(fā)揮作用。雖然鹽橋的形成通常被視為積極有利的，這些相互作用力的穩(wěn)定取決于外界周圍的環(huán)境。非極性環(huán)

27、境能夠增加能量使得鹽橋形成，而高極性環(huán)境或低pH值降低這些相互作用力。值得注意的是，JAM-A二聚體在高離子強度或當暴露在低pH值可以電離成單體[23]。JAM-A動態(tài)性質可能有利于病毒附著蛋白的結合[24]。序列圖表明，二聚體形成的大部分殘留物在JA</p><p>　　[2]. Mann MA, Knipe DM, Fischbach GD, Fields BN (2002) Type 3 reovirus

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