新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)方法及細(xì)胞適應(yīng)性的研究.pdf

1、新型鴨呼腸孤病毒病是近年來(lái)新出現(xiàn)的疫病，主要特征為肝、脾臟不規(guī)則出血、壞死與心肌、腔上囊出血，最初被稱為“鴨白點(diǎn)病”、“鴨新肝病”、“鴨壞死性肝炎病”等?，F(xiàn)已確定該病是由新型鴨呼腸孤病毒引起。為了提高新型鴨呼腸孤病毒感染診斷的準(zhǔn)確性、靈敏度和實(shí)效性，本研究建立了NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法和RT-LAMP檢測(cè)方法。另外，本研究還對(duì)該病毒在不同細(xì)胞上的適應(yīng)性進(jìn)行分析，并將該病毒在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)上進(jìn)行了克隆純化與傳代，為該

2、病弱毒疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究分為三部分:
　　1.NDRV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　根據(jù)NDRV S1基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，建立基于SYBR GreenⅠ的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)含目的基因的質(zhì)粒拷貝數(shù)與定量反應(yīng)Ct值的關(guān)系，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法敏感性高，比普通常規(guī)PCR高100倍，并具有良好的特異性和重復(fù)性。利用該方法對(duì)人工感染死亡雛鴨的不同組織器官進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

3、脾臟和肝臟中的含毒量較高。
　　2.NDRV RT-LAMP檢測(cè)方法的建立
　　基于NDRV S3基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測(cè)方法。該方法具有良好的特異性，敏感性為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為98％，而且對(duì)儀器要求低，適于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。