鋸緣青蟹呼腸孤病毒與雙順反子病毒檢測方法及分子流行病學研究.pdf

1、鋸緣青蟹(Scylla serrata)是我國重要的經(jīng)濟蟹類，2005年從暴發(fā)“嗜睡癥”的蟹中分離出兩種大小不同的病毒，較大的病毒直徑為60-70nm，經(jīng)DNA酶及RNA酶消化后確定為雙鏈RNA病毒，基因組由12節(jié)段的雙鏈RNA組成，屬于呼腸孤病毒科，命名為鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Mud Crab Reovirus，MCRV)；較小的病毒直徑為20-30nm，經(jīng)DNA酶及RNA酶消化后確定為單鏈RNA病毒，基因組由一條單鏈RNA組成，全基因

2、組測序完成后，經(jīng)過分析，具有雙順反子病毒科的特征，命名為鋸緣青蟹雙順反子病毒(Mud Crab Dicistrovirus，MCDV)。這兩種病毒對鋸緣青蟹都有很強的致病性，本文對這兩種病毒的檢測方法、流行病學進行了研究。
　　 本文建立了呼腸孤病毒和雙順反子病毒的特異性巢式PCR方法，檢測限可分別達到0.003pg和0.002pg，運用該方法檢測不同感染時期不同組織中的呼腸孤病毒和雙順反子病毒，在注射感染早期的樣品中，只用一步

3、PCR可以在心、肝胰腺、腸、胃、食道、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、血中檢測到呼腸孤病毒；只用一步PCR可以在心、肝胰腺、腸、食道、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、鰓、血淋巴中檢測到雙順反子病毒，用巢式PCR可以在胃中檢測到雙順反子病毒；在瀕死的樣品中，只用一步PCR就可以在上述共九種組織中檢測到這兩種病毒。運用巢式PCR于2009年8月到2010年2月對粵中海區(qū)共21種野生蟹類進行流行病學調(diào)查，均未檢測出兩種病毒，但是，于2008年至2010年對廣州南沙及珠海

4、養(yǎng)殖場的鋸緣青蟹檢測結(jié)果表明，呼腸孤病毒感染率較高，在43％以上，雙順反子病毒的感染率在2％以上。
　　 建立了針對這兩種病毒的特異性熒光實時定量PCR方法(Taqman探針法)，運用該方法檢測不同感染時期不同組織中呼腸孤病毒和雙順反子病毒的量，結(jié)果顯示，這兩種病毒在鋸緣青蟹心臟、鰓、肌肉、肝胰腺、血淋巴中均有分布，呼腸孤病毒量組織從多到少依次為：鰓、心臟、肝胰腺、肌肉、血淋巴；組織雙順反子病毒分布量從多到少分別是鰓、肝胰腺、心

5、臟、血淋巴、肌肉。把檢測結(jié)果與蟹的死亡率聯(lián)系起來，推測雙順反子病毒與呼腸孤病毒共同作用引起鋸緣青蟹死亡。
　　 本文進行人工感染實驗，分別用注射、投喂、浸泡、禁食浸泡、共居的方式研究這兩種病毒的感染途徑，用巢式PCR和實時熒光定量PCR的方法進行檢測。結(jié)果表明，呼腸孤病毒及雙順反子病毒能通過人工注射、浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染鋸緣青蟹。人工注射感染方式感染率最高，而且死亡出現(xiàn)的時間最早，投喂感染方式較浸泡、共居方式MC