檢測(cè)兩型鴨圓環(huán)病毒雙重PCR方法的建立和分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，基因組為單股共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，整個(gè)基因組大小約為2kb。鴨圓環(huán)病毒主要侵害病鴨的胸腺、法氏囊等免疫器官。鴨感染DuCV后表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育障礙、生長(zhǎng)停滯，在出殼幾周內(nèi)發(fā)病，生長(zhǎng)停滯和羽毛形狀失常。近年來(lái)實(shí)驗(yàn)室建立了檢測(cè)鴨圓環(huán)病毒的PCR方法和ELISA方法，但至今沒(méi)有快速對(duì)鴨圓環(huán)病毒的分型檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)利用

2、兩型鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白基因序列的特異性對(duì)兩型鴨圓環(huán)病毒分型。
　　本研究主要進(jìn)行了如下工作:
　　1.檢測(cè)兩種基因型鴨圓環(huán)病毒雙重PCR方法的建立
　　DuCV存在兩個(gè)基因型，兩型DuCV的Cap基因核酸序列同源性在78％左右，二者之間的Cap蛋白序列的同源性只有77.6％左右，抗原表位預(yù)測(cè)分析表明二者之間也存在較大差異。而根據(jù)DuCV基因組同源性分型結(jié)果和Cap蛋白序列的分型結(jié)果基本一致，因此，我們選擇Cap蛋白對(duì)

3、DuCV進(jìn)行分型鑒定。通過(guò)對(duì)從Genbank上下載的56個(gè)DuCV序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)合兩個(gè)基因型DuCV Cap基因比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了四條特異性引物，并對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了雙重PCR檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明，該方法特異性強(qiáng)，能夠?qū)尚虳uCV進(jìn)行分型檢測(cè)，且不受組織DNA和其他病原的影響;靈敏度高，最多能夠檢測(cè)到10個(gè)拷貝的鴨圓環(huán)病毒DNA，能夠用于DuCV的分型檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。
　　2.利用雙重PCR方法對(duì)

4、山東地區(qū)養(yǎng)鴨場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)檢測(cè)
　　我們?cè)诓煌瑫r(shí)間采集了濰坊地區(qū)的8個(gè)鴨群共120只（每個(gè)鴨群15只）齡病死弱雛，采集其肝臟、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、心臟等器官進(jìn)行DuCV檢測(cè)。使用建立的雙重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行分子流行病學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明:3個(gè)鴨群(37.5％)檢出DuCV-1和DuCV-2的混合感染，3個(gè)鴨群(37.5％)檢出DuCV-2的單獨(dú)感染。15只雛鴨被檢出感染DuCV，其中3.33％(4/120)的雛鴨檢出DuCV

5、-1和DuCV-2的混合感染，9.17％(11/120)的雛鴨只感染DuCV-1或DuCV-2。采集泰安地區(qū)8個(gè)鴨群共120只雛鴨（每個(gè)鴨群15只）以同樣的方法進(jìn)行流行病學(xué)檢測(cè)，沒(méi)有檢出DuCV感染。試驗(yàn)結(jié)果表明山東省老養(yǎng)殖區(qū)鴨群中存在較為嚴(yán)重的DuCV-1和DuCV-2混合感染的現(xiàn)象。
　　3.對(duì)鴨圓環(huán)病毒是否垂直傳播的初步探究
　　王鑫等于2012年對(duì)濰坊地區(qū)鴨場(chǎng)進(jìn)行DuCV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鴨場(chǎng)DuCV-1陽(yáng)性率為27.32％

6、，DuCV-2陽(yáng)性率為42.81％。我們對(duì)DuCV感染陽(yáng)性的某種鴨場(chǎng)中進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，共收集了80枚未孵化的種蛋、30只孵化過(guò)程中出現(xiàn)的死胚和120只剛出殼的雛鴨作為檢測(cè)對(duì)象，用本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行分子流行病學(xué)檢測(cè)。種蛋中DuCV-2單獨(dú)感染陽(yáng)性率為2.50％，兩型DuCV混合感染率為1.25％，沒(méi)有檢測(cè)到DuCV-1單獨(dú)感染;死胚中DuCV-1單獨(dú)感染率為3.33％，DuCV-2單獨(dú)感染率為6.67％，兩型DuCV混合感