我國部分地區(qū)羊梨形蟲病PCR檢測(cè)方法建立及分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、羊寄生蟲病是對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重影響的疾病之一，羊在感染寄生蟲后，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，飼料報(bào)酬降低，降低了羊的產(chǎn)肉量和產(chǎn)奶量。有的疾病可使懷孕母羊流產(chǎn)或早產(chǎn)，受胎率降低，羔羊成活率下降，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加，經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。梨形蟲病(泰勒蟲病和巴貝斯蟲病)是寄生于脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞或者其他細(xì)胞內(nèi)的蜱傳性寄生蟲病，可導(dǎo)致山羊、綿羊發(fā)熱、貧血、消瘦、黃疸、血紅蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，常給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。此

2、外，由無該病地區(qū)引進(jìn)的羊?qū)嫘蜗x極為敏感，發(fā)病率和死亡率均較高。因此，該病也嚴(yán)重阻礙著優(yōu)良品種的引進(jìn)和地方品種改良工作。據(jù)報(bào)道，世界許多國家和地區(qū)都發(fā)生過梨形蟲病。從2011年1月到2012年2月，應(yīng)用多種檢查方法對(duì)從我國部分地區(qū)采集的1043份糞便樣品，進(jìn)行了山羊腸道寄生蟲感染情況調(diào)查。期間，對(duì)我國部分地區(qū)的羊梨形蟲病進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行了基于18SrRNA基因的PCR方法對(duì)陽性樣品進(jìn)行了種類鑒定和種系發(fā)育分析。
　　 1.為了解

3、我國部分地區(qū)山羊腸道寄生蟲感染情況，對(duì)山羊腸道寄生蟲病的防治提供參考依據(jù)。于2011年1月到2012年2月，應(yīng)用離心沉淀法、盧戈氏碘液染色法、飽蔗糖溶液漂浮法和麥克馬斯特計(jì)數(shù)法等多種檢查方法對(duì)河南省部分地區(qū)，安徽合肥，重慶云陽、青海鄂陵湖、內(nèi)蒙古呼和浩特等11個(gè)縣市的1043份山羊糞便樣品進(jìn)行采集與檢測(cè)。結(jié)果共檢測(cè)到球蟲、隱孢子蟲、賈第蟲、阿米巴、鞭蟲、細(xì)頸線蟲、其他線蟲、莫尼茨絳蟲、矛形雙腔吸蟲等9種(類)寄生蟲，總感染率為95.9％

4、。多呈混合感染，最多可同時(shí)感染6種，以混合感染2種寄生蟲和3種寄生蟲居多，感染率分別為30.3％和31.7％。其中球蟲為優(yōu)勢(shì)感染蟲種，感染率達(dá)到90.8％，矛形雙腔吸蟲感染率最低，僅為0.67％；不同季節(jié)羊賈第蟲感染率存在顯著的差異，夏季感染率(11.1％)高于春季(4.72%)和秋季(5.41％)；隱孢子蟲感染見于春、秋和冬季，秋季感染率(4.63％)顯著高于春季和冬季，而且幼齡羊的隱孢子蟲感染率(3.77%)高于成年羊感染率(0.1

5、6％)，舍飼羊群隱孢子蟲感染率(1.58％)略高于放牧羊群(1.47％)。結(jié)果表明山羊腸道寄生蟲感染較為普遍和嚴(yán)重，并攜帶人獸共患寄生蟲，應(yīng)加強(qiáng)其腸道寄生蟲病的綜合防治。
　　 2.為查明我國部分地區(qū)感染羊的巴貝斯蟲、泰勒蟲的種類及分子流行病學(xué)特征，為制定有效防治措施提供依據(jù)。于2011年4月到2011年12月，根據(jù)河南省的不同地域和飼養(yǎng)方式，選取河南省的鄭州市、中牟縣、登封市、信陽市商城縣、三門峽市(靈寶市、盧氏縣)、安陽市以

6、及遼寧省朝陽市、山東省臨朐市等11個(gè)縣市，共采集血液樣品212份。采用傳統(tǒng)的姬姆薩染色法和PCR檢測(cè)方法(常規(guī)PCR和巢式PCR)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。姬姆薩染色檢查，檢查到的陽性樣品有21份，感染率為9.90％(21/212)，PCR方法檢測(cè)，檢測(cè)到陽性樣品有46份，感染率為21.7％(46/212)；利用呂氏泰勒蟲特異性引物擴(kuò)增證明，所得到的陽性樣品均為呂氏泰勒蟲。對(duì)采集的硬蜱進(jìn)行種類鑒定，均為長(zhǎng)角血蜱。這次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲。結(jié)果表明，

7、PCR檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的姬姆薩染色鏡檢方法要敏感、特異。所得到的泰勒蟲陽性樣品經(jīng)鑒定均為呂氏泰勒蟲
　　 3.為確定我國部分地區(qū)羊泰勒蟲分離株的種類，對(duì)18srRNA序列擴(kuò)增出的46個(gè)羊泰勒蟲分離株序列在NCBI中Blast比對(duì)，然后搜索相關(guān)核酸序列用ClustalX1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用DNAStar4.0軟件進(jìn)行同源序列分析，應(yīng)用ClustalX1.83和Phylip3.64等生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建分子進(jìn)化樹。結(jié)

8、果：Blast比對(duì)和同源性分析時(shí)，基于18SrRNA基因的46個(gè)泰勒蟲分離株與Theilerialuwenshuni(JF719831.1)、Theileriasp.SZH-sheep(HQ844674.1)同源性為100％；在建立的系統(tǒng)發(fā)育樹上，所得到的46株分離株與T.luwenshuni(JF719831.1)和Theileriasp.SZH-sheep(HQ844674.1)在同一分支上。結(jié)果證明，所分離劍的泰勒蟲均為呂氏泰勒蟲