豬博卡病毒在我國部分地區(qū)的分子流行病學調查及其熒光定量PCR方法的建立與應用.pdf

1、細小病毒科中博卡病毒屬成員具有特征性的第三個開放閱讀框(Open ReadingFrame，ORF)，其中豬博卡病毒(Porcine bocaviruses，PBoVs)表現(xiàn)出最強的遺傳多樣性?；谝職さ鞍?Capsid protein，VP1)核苷酸及氨基酸序列進行分類，將已經(jīng)報道的15株近全長序列分為了9個種:PoBoV1包含porcine boca-like virus(PBo-likeV)和PBoV1-H8,PoBoV2包含po

2、rcine parvovirus4-c14(PPV4-c14)和PPV4-c17,PoBoV3包含PBoV1、PBoV2和PBoV2-A6，PoBoV4-8分別包含6V，PBoV3-NI，PBoV4-NI，PBoV3-HK和PBoV4-1-HK、PBoV4-2-HK，PoBoV9包含7V和PBoV5。其中PoBoV3及PoBoV9各有2個基因型。對收集自中國2010年10省市的166份病料進行PBo-likeV、PPV4、PBoV1、P

3、BoV2、6V、7V、PBoV3-NI及PBoV4-NI檢測顯示，其陽性率分別為28.9％、6.6％、9.0％、12.7％、22.3％、31.3％、15.1％和14.5％。PBoVs之間及其與其他常見病毒如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)和豬瘟病毒(Cla

4、ssical swine fever virus，CSFV)共感染非常普遍。
　　 通過PCR方法擴增了PoBoV1的NP1基因，將其連接到表達載體pET32(P3)中，構建了重組質粒NP1-pET32(P3)。轉化后在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導表達，獲得大小約55KD以可溶形式存在于菌體中的NP1重組蛋白。蛋白經(jīng)鎳柱純化后免疫實驗兔，獲得抗血清。制備的血清通過ELISA發(fā)現(xiàn)抗體效價達到1∶64000，Weste

5、rn-blot鑒定顯示多抗能與NP1蛋白發(fā)生特異性免疫反應。
　　 根據(jù)當時GenBank中公布的唯一PoBoV1基因組序列（登錄號:FJ872544），針對其結構蛋白VP1基因的保守序列，設計合成特異性擴增引物及Taqman探針。以本實驗室構建的pPBoVZJ0901克隆質粒為標準品，通過對退火溫度、反應總體系、探針濃度以及模板濃度進行調整，建立了PoBoV1的Taqman熒光定量PCR方法。優(yōu)化反應條件后，特異性檢測試驗發(fā)現(xiàn)

6、，用該方法檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬源牛病毒性腹瀉病毒及其他基因型豬博卡病毒等結果均呈陰性，而檢測PoBoV1陽性病料呈陽性。敏感性檢測試驗表明該方法在4.89×100copies/μl～4.89×109copies/μl范圍內線性關系良好，最低檢測限為4.89×100copies/μl。重復性試驗結果顯示組內及組間變異系數(shù)均低于3％。用建立的熒光定量PCR方法檢測實驗豬不同時期所采集的血清及處死后收集的各