中國(guó)和巴基斯坦部分地區(qū)牛梨形蟲病病原分子流行病學(xué)、血清學(xué)研究.pdf

1、泰勒蟲病是由媒介蜱傳播的泰勒蟲寄生于宿主紅細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞所引起的血液原蟲病，發(fā)病動(dòng)物以發(fā)熱、貧血、黃疸、體表淋巴結(jié)腫脹，甚至死亡，為典型臨床癥狀。據(jù)報(bào)道，梨形蟲病每年在全世界范圍內(nèi)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)損失，包括動(dòng)物死亡、生產(chǎn)性能下降及防治費(fèi)用。因此，建立快速特異的診斷檢測(cè)方法，并對(duì)牛泰勒蟲病的流行情況進(jìn)行調(diào)查，闡明中國(guó)和巴基斯坦兩國(guó)部分地區(qū)的梨形蟲種類與分布特征，可為牛梨形蟲病的防控提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。
　　依據(jù)環(huán)形泰勒蟲

2、烯醇化酶基因序列，設(shè)計(jì)引物，建立了可擴(kuò)增大小281bp基因片段的RPA快速檢測(cè)方法。對(duì)建立的RPA方法和常規(guī)PCR方法的檢測(cè)效果進(jìn)行了對(duì)比，通過(guò)對(duì)274份野外樣本的檢測(cè)，RPA方法檢測(cè)出48份陽(yáng)性樣品(17.51％)，常規(guī)PCR檢測(cè)出21份環(huán)形泰勒蟲陽(yáng)性樣品(7.66％)，結(jié)果顯示RPA檢測(cè)萬(wàn)法的敏感性明顯高于常規(guī)PCR。為證實(shí)RPA檢測(cè)結(jié)果的正確性，對(duì)RPA檢測(cè)呈陽(yáng)性而常規(guī)PCR為陰性的樣品進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。
　　在野外環(huán)境下，環(huán)

3、形泰勒蟲與東方泰勒蟲經(jīng)常以混合感染的情況出現(xiàn)。為能夠同時(shí)并鑒別診斷兩種泰勒蟲，本研究中建立了能夠同時(shí)檢測(cè)環(huán)形泰勒蟲和東方泰勒蟲的多重RPA檢測(cè)方法。根據(jù)兩種泰勒蟲的烯醇化酶基因序列，分別設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增引物，其中，環(huán)形泰勒蟲的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為282bp，東方泰勒蟲的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229bp。特異性試驗(yàn)證實(shí)，該方法可特異性地?cái)U(kuò)增兩種泰勒蟲，而與其他梨形蟲DNA無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該多重RPA檢測(cè)方法最低能夠檢出100

4、拷貝的烯醇化酶基因的質(zhì)粒DNA，具有較好的檢測(cè)敏感性。為驗(yàn)證多重RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值，分別用建立的多重RPA方法和已報(bào)道的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)188份樣品中環(huán)形泰勒蟲和東方泰勒蟲的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。多重RPA檢測(cè)出環(huán)形泰勒蟲陽(yáng)性樣品45份(23.9％)和東方泰勒蟲陽(yáng)性樣品5份(2.6％)。多重PCR方法檢測(cè)出環(huán)形泰勒陽(yáng)性32份(17％)和東方泰勒蟲陽(yáng)性3份(1.6％)。
　　為了解巴基斯坦梨形蟲病的流行情況，在Chakwa

5、l、Jhang和Faisalabad三個(gè)地區(qū)，選擇有蜱叮咬但無(wú)臨床癥狀的牛，用FTA卡共采集血液樣品450份。應(yīng)用已發(fā)表的針對(duì)梨形蟲18SrRNA V4高變區(qū)的巢式PCR方法，對(duì)采集的樣品進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果顯示，在樣品采集地區(qū)主要存在環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲。采集的樣品中，梨形蟲病痛原的陽(yáng)性率為28.44％(128/450)。其中環(huán)形泰勒蟲陽(yáng)性率為22.89％、東方泰勒蟲陽(yáng)性率為3.11％、雙芽巴貝斯蟲陽(yáng)性率為2.44％。樣

6、品采集的三個(gè)地區(qū)中，Chakwal地區(qū)梨形蟲病流行情況最為嚴(yán)重，梨形蟲感染陽(yáng)性率達(dá)58.51％。為進(jìn)一步了解巴基斯坦和中國(guó)地區(qū)梨形蟲病病原的基因相關(guān)性。從中國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)的120份樣品中篩選出梨形蟲陽(yáng)性DNA樣品16份，與巴基斯坦地區(qū)篩選出的梨形蟲基因序列進(jìn)行基因相關(guān)性分析。核糖體18S rRNA全長(zhǎng)序列和棒狀體相關(guān)蛋白基因分別用于泰勒蟲和雙芽巴貝斯蟲的基因相關(guān)性分析。
　　采用以重組的主要梨形蟲表面蛋白(rMPSP)為抗原建立的間