呼腸孤病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的治療作用.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞在癌癥中扮演了一個(gè)重要角色，因?yàn)檫@些細(xì)胞具有增強(qiáng)的形成腫瘤的能力并且對(duì)現(xiàn)有的抗癌治療存在抵抗作用。因此，必須找到新癌癥治療方法既能消退腫瘤又能針對(duì)腫瘤干細(xì)胞從而達(dá)到徹底關(guān)閉腫瘤細(xì)胞的目的。
　　 過(guò)去數(shù)年里對(duì)溶瘤病毒治療惡性腫瘤的研究越來(lái)越多。溶瘤病毒能在易感的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，能在腫瘤內(nèi)或者轉(zhuǎn)移灶內(nèi)瞄準(zhǔn)、感染并且毀滅殘留的腫瘤細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程能自行重復(fù)直到被宿主的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)清除病毒。許多研究顯示呼腸孤病毒3型對(duì)人類不

2、致病而且導(dǎo)致人腫瘤細(xì)胞的死亡，本課題研究呼腸孤病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的治療作用。
　　 一、NOD/SCID鼠異種原位移植乳腺癌模型的建立
　　 目的：建立NOD/SCID鼠異種原位移植乳腺癌模型并鑒定其生物學(xué)特性是否與原發(fā)腫瘤一致。
　　 方法：采用手術(shù)中獲得的ER強(qiáng)陽(yáng)性的乳腺癌患者的腫瘤組織塊移植到NOD/SCID鼠的乳房脂肪墊上。經(jīng)過(guò)3次篩選傳代，移植模型趨于穩(wěn)定并進(jìn)行鑒定。通過(guò)HE、TUNEL、DCC和免疫組

3、化等方法，分析乳腺癌異種移植模型的生物學(xué)特性。
　　 結(jié)果：建立ER陽(yáng)性的人乳腺癌異種移植NOD/SCID鼠模型必須有雌激素輔助。在雌激素輔助下移植成功率可以達(dá)到29.6％，沒(méi)有雌激素輔助的腫瘤不能成活(P<0.01)。免疫組化和DCC測(cè)定提示移植瘤模型的ER均為陽(yáng)性。HE、TUNEL等提示模型保持了原移植物的生物學(xué)特性。
　　 結(jié)論：NOD/SCID鼠乳腺癌模型傳代穩(wěn)定，符合建立模型的篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)保持了原發(fā)癌的生物學(xué)

4、特性，表明模型鼠成功建立。
　　 二、乳腺癌干細(xì)胞的富集和微球體形成的影響因素
　　 目的：探討MCF-7細(xì)胞、BT474細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞微球體形成的影響因素，并檢測(cè)其CD44+CD24-/low的表達(dá)比例，明確富集干細(xì)胞的方法，以獲得穩(wěn)定數(shù)量的干細(xì)胞。
　　 方法：將MCF-7、BT474和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行微球體培養(yǎng)，取培養(yǎng)第7天的微球體細(xì)胞分別進(jìn)行干細(xì)胞表型的FCM檢測(cè)分析，判

5、斷干細(xì)胞富集的程度。
　　 結(jié)果：MCF-7、BT474和MDA-MB-231細(xì)胞形成微球體的效率分別為2.4％±0.2％、1.6％±0.1％和0.6％±0.05％。在通常的干細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA-MB-231細(xì)胞很難聚團(tuán)生長(zhǎng)。但是如果去除胰島素，MDA-MB-231細(xì)胞則聚團(tuán)生長(zhǎng)。單層培養(yǎng)細(xì)胞中MCF-7、BT474和MDA-MB-231的CD44+CD24-/low的比例為10％±0.2％、0.3％±0.05％和37％±1.8

6、％，微球體細(xì)胞中CD44+CD24-/low的比例分別為8.1％±0.4％、0.6％±0.2％和93.8％±2.1％，乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)CD44+CD24-/low細(xì)胞表型的比例明顯低于同種細(xì)胞培養(yǎng)的微球體(p<0.01)。
　　 結(jié)論：通過(guò)微球體培養(yǎng)，富集了腫瘤干細(xì)胞，但是不同乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的微球體中干細(xì)胞所占的比例差異很大，MDA-MB-231細(xì)胞最高。
　　 三、溶瘤病毒呼腸孤病毒3型的擴(kuò)增鑒定
　　 目的：

7、擴(kuò)增呼腸孤病毒并且進(jìn)行特異性鑒定和活力測(cè)定。
　　 方法：在LLC-MK2細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增病毒，首先通過(guò)特征性致細(xì)胞病變?nèi)缂?xì)胞聚團(tuán)和脫落鑒定病毒，通過(guò)Real-Time PCR(RT-PCR)鑒定病毒的純度。用TCID50進(jìn)行病毒活力測(cè)定。
　　 結(jié)果：從特征性致細(xì)胞病變看LLC-MK2細(xì)胞對(duì)呼腸孤病毒非常敏感。從上清獲得的病毒的特異性得到RT-PCR確認(rèn)，活力測(cè)定顯示上清中呼腸孤病毒的溶度為107.33 TCID50/m

8、l，活性很高。
　　 結(jié)論：呼腸孤病毒能夠通過(guò)LLC-MK2細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增并純化，而且這種方法有利于保存病毒并且有利于對(duì)其結(jié)構(gòu)和特性進(jìn)行持續(xù)研究。
　　 四、呼腸孤病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的治療作用
　　 目的：探討呼腸孤病毒在體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞的治療作用，在體內(nèi)對(duì)乳腺癌實(shí)體瘤的治療作用和對(duì)其他重要臟器的影響。
　　 方法：比較呼腸孤病毒和表阿霉素作用下MCF-7、BT474細(xì)胞及其微球體中干細(xì)胞

9、表型CD44+CD24-/low的表達(dá)變化(FCM法)以及細(xì)胞凋亡的變化(TUNEL法)，研究呼腸孤病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的治療作用。呼腸孤病毒感染人乳腺癌原位移植NOD/SCID鼠模型，通過(guò)TUNEL和HE研究該病毒在體內(nèi)對(duì)腫瘤和其他重要臟器的影響。
　　 結(jié)果：在表阿霉素作用下MCF-7和BT474微球體細(xì)胞中表達(dá)CD44+CD24-/low比例明顯升高，為18％±4.5％和0.9％±0.13％(P<0.01)。病毒感染后MCF

10、-7和BT474微球體細(xì)胞中表達(dá)CD44+CD24-/low比例明顯下降，分別為0.8％±0.2％和0.2%±0.1％(P<0.05)。BT474和MCF-7微球體在應(yīng)用病毒以后凋亡率上升明顯，MCF-7的凋亡率從1.9％±0.21％上升至5％±1.4％，BT474的凋亡率從0.2％±0.1％上升至1％±0.16％(P<0.05)。此外，病毒作用于NOD/SCID鼠乳腺癌動(dòng)物模型，可致腫瘤細(xì)胞大量裂解消失，凋亡增加，同時(shí)對(duì)肺有損傷。