抗草魚呼腸孤病毒藥物篩選細(xì)胞模型及分子檢測(cè)方法的建立.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，占我國(guó)淡水魚總產(chǎn)量的20％左右。草魚以其生長(zhǎng)快，飼料來源廣及肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)而深受廣大養(yǎng)殖者與消費(fèi)者歡迎。但是，由于草魚易患多種疾病，而嚴(yán)重制約了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，特別是病毒性草魚出血病，其發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)，流行區(qū)域廣，死亡率高，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因而，草魚出血病的防控技術(shù)研究一直是科研工作者長(zhǎng)期的研究重點(diǎn)。免疫預(yù)防方法是預(yù)防草魚出血病最為有效的方法。由于

2、免疫預(yù)防技術(shù)離大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用尚有較大的距離，因此，尋找有效的藥物來預(yù)防和治療草魚出血病對(duì)草魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展有重要意義。
　　 本研究以草魚腎臟細(xì)胞系(CIK)和草魚呼腸孤病毒(GCRV)為材料，進(jìn)行抗病毒藥物篩選研究。采用四噻唑鹽染色法(MTT)方法進(jìn)行了穿琥寧、板藍(lán)根、黃芩、利巴韋林等藥物抗GCRV的效果評(píng)價(jià)，建立了體外抗GCRV藥物篩選的細(xì)胞模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，直接檢測(cè)病毒核酸量的變化評(píng)價(jià)藥物抑制病毒的作用效果

3、，建立了體外抗GCRV藥物篩選的分子檢測(cè)方法。
　　 MTT研究結(jié)果，在先給藥后感染試驗(yàn)組，穿琥寧在阻斷GCRV吸附和侵入細(xì)胞時(shí)效果最強(qiáng)，其次是利巴韋林和板藍(lán)根，黃芩的阻斷效果最弱，其治療指數(shù)分別為810±47，108±13，35.28±8.35和18.08±3.76。在先感染后給藥的試驗(yàn)中，穿琥寧、利巴韋林和黃芩抑制GCRV增殖的作用顯著，治療指數(shù)分別為358±26，555±48和74.2±12.53，板藍(lán)根抑制病毒增殖的作用

4、不明顯。在藥物與病毒先共同孵育后感染的試驗(yàn)組中，利巴韋林對(duì)GCRV有一定直接殺滅作用，其治療指數(shù)為102±16，黃芩、板藍(lán)根和穿琥寧等的體外殺病毒效果不明顯。
　　 在分子檢測(cè)技術(shù)中，以GCRV-VP6蛋白編碼基因?yàn)槟０?，采用?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，測(cè)定藥物試驗(yàn)組與對(duì)照組病毒感染細(xì)胞后的GCRV-VP6編碼基因的拷貝數(shù)，先感染后給藥的研究結(jié)果表明，穿琥寧試驗(yàn)組檢測(cè)不到GCRV-VP6編碼基因，利巴韋林試驗(yàn)組中GCRV-VP6編碼