抗乙型肝炎病毒藥物篩選評價體系的建立及肝康栓抗乙型肝炎病毒的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 建立一套檢測乙型肝炎病毒基因的Taqman探針實時熒光定量PCR系統(tǒng)、分別利用HepG2.2.15細胞模型和鴨乙型肝炎模型于體外、體內研究乙型肝炎病毒，從而建立并完善抗乙型肝炎病毒藥物篩選、評價體系。并利用該體系評價肝康栓體內、外抗乙型肝炎病毒的作用。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)病毒基因組和核苷酸序列特點，分別設計3對特異性引物及Taqman探針。利用這3對引物分別擴增HBV DNA、DHBV D

2、NA及DHBV cccDNA目的基因片段。PCR產物純化、回收后，克隆入pUCm-T載體，轉化DH5a菌株，篩選陽性菌落，提取重組質粒。重組質粒經PCR及測序鑒定后，用于制備實時熒光定量PCR的標準品和繪制標準曲線。通過優(yōu)化反應體系和循環(huán)參數(shù)，建立乙型肝炎病毒基因Taqman探針實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。并進一步評價該系統(tǒng)的靈敏度、特異度及可重復性。
　　 2.體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞，觀察該細胞培養(yǎng)1、2、4、6、8

3、、10、12、14天時的生長情況和HBsAg、HBeAg的分泌情況。用MTT法檢測肝康栓和拉米夫定對HepG2.2.15細胞的細胞毒性作用，計算肝康栓和拉米夫定的半數(shù)中毒濃度。并分別用ELISA法或PCR法檢測肝康栓（12mg/ml、10mg/ml、6mg/ml和5mg/ml的終濃度）與拉米夫定（0.2mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和25mg/ml的終濃度）作用4、7、10天時，HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、H

4、BeAg、HBV DNA的抑制作用。計算培養(yǎng)第10天時肝康栓和拉米夫定抑制HepG2.2.15細胞上清液中HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA復制的半數(shù)有效濃度。最后評價肝康栓的選擇指數(shù)。
　　 3.分別提取244份武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨血清中的DHBV DNA，并進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳。估計武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨DHBV攜帶率。取1日齡櫻桃谷雛鴨96只，利用PCR法篩選先天DHBV DNA（－）雛鴨用于制備動物模型，

5、并估計櫻桃谷雛鴨DHBV自然感染率。通過脛靜脈注射DHBV DNA強陽性血清（0.2ml/只），利用先天DHBV DNA（－）雛鴨制備后天感染鴨乙型肝炎病毒動物模型，并計算DHBV造模感染率。
　　 4.采用正常櫻桃谷雛鴨研究肝康栓短期毒性反應。將后天感染鴨乙型肝炎病毒動物模型雛鴨隨機分為：模型對照組，ACV對照組，大、中、小劑量肝康栓治療組，每組12只；再取12只2周齡的正常雛鴨作為正常對照組。分別于第一次給藥前（T0）、給藥

6、14d（T14）、給藥28d（T28）和停藥7d（P7）時，脛靜脈取血（0.5ml/只），分離血清，檢測肝康栓對雛鴨血清中DHBV DNA的抑制情況和血清ALT、AST的影響。并于停藥7d時將各組鴨處死，統(tǒng)一取肝右葉2塊組織，分別用于檢測肝臟DHBV DNA、DHBV cccDNA和組織病理學。
　　 結果:
　　 1.本實驗成功構建了pUCm-HBV DNA、pUCm-DHBV DNA和pUCm-DHBV cccDN

7、A三種質粒標準品。在（1×102～1×109）copies/ml濃度范圍內，三種標準品的含量與Ct值的相關系數(shù)r分別為-1.00、－0.999和－0.997。（5×103～5×108）copies/ml 6個濃度的三種質粒標準品，在同一實時熒光定量PCR儀上重復進行4次擴增，Ct值的變異系數(shù)均小于5%。利用本實驗所建立的Taqman探針實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測HBV DNA、DHBV DNA和DHBV cccDNA的靈敏度分別為：5×

8、101copies/ml、5×101copies/ml和1×102copies/ml；并且HBV DNA陽性上清液、DHBV DNA陽性鴨血清和DHBV cccDNA陽性鴨肝組織用本法檢測均出現(xiàn)陽性擴增，而空白的培養(yǎng)基、正常鴨血清及正常鴨肝組織均未出現(xiàn)陽性擴增。
　　 2.①HepG2.2.15細胞按1×106/L濃度接種、培養(yǎng)后，第8～12天細胞生長狀態(tài)最佳；并且用ELISA法檢測培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1天后，檢測細胞上清液中的H

9、BsAg和HBeAg均為陽性，其后培養(yǎng)上清液中HBsAg及HBeAg的分泌量隨著培養(yǎng)時間的增長而逐漸增加，在培養(yǎng)第10天達到高峰。培養(yǎng)第1-6天時HBsAg分泌增長速度較HBeAg快；但是整個培養(yǎng)過程中，HBeAg分泌量均高于同時期HBsAg的分泌量。
　　 ②肝康栓在（7.5～60）mg/ml濃度范圍內，對HepG2.2.15細胞增殖的抑制作用隨肝康栓的濃度增加而增強，當肝康栓濃度小于15mg/ml時，對細胞增殖的抑制率<20

10、%。
　　 ③12mg/ml的肝康栓作用10天后，HBsAg、HBeAg的抑制率達最大，分別為68.2%和62.7%。呈明顯的時間和劑量依賴性；而3TC在25mg/ml濃度下作用7天，HBsAg、HBeAg的抑制率最大，分別為50.1%和47.3%。且3TC培養(yǎng)10天時，HBsAg、HBeAg的抑制率均較培養(yǎng)7天時減弱。無明顯的時間依賴性。
　　 ④肝康栓在12mg/ml濃度、作用10天時，對HepG2.2.15細胞上清

11、中HBV DNA的抑制率較強，為78.8%；而3TC在25mg/ml濃度、作用10天時，對HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA的抑制率最強，為97.9%。
　　 ⑤肝康栓和3TC抑制HBV DNA的選擇指數(shù)分別為6.14和31450.5。
　　 3.在244份武漢地區(qū)采集的成年櫻桃谷鴨血清標本中，52份為DHBV DNA陽性血清，估計武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨DHBV攜帶率為：[16.64%～26.87%]（95%置

12、信區(qū)間）。而96只1日齡櫻桃谷雛鴨中，在接種前檢測DHBV DNA，只有11只為DHBV DNA陽性，估計櫻桃谷雛鴨DHBV自然感染率為[6.52%～19.36%]（95%置信區(qū)間）。隨機選取1日齡DHBV DNA(－)的櫻桃谷雛鴨80只，接種DHBV DNA強陽性血清1周后，69只為DHBV DNA陽性，8只為陰性，3只死亡，DHBV造模感染率為86.25%。
　　 4.①肝康栓大、中、小劑量組雛鴨給藥前、給藥7天、給藥14

13、天、給藥28天時，與對照組雛鴨相比，在羽毛色澤，步態(tài)，進食狀況，精神狀態(tài)，對刺激的反應等方面也均無明顯差異；各組雛鴨在試驗各階段，體重及體重增重值均無統(tǒng)計學差異（p>0.05）。
　　 ②肝康栓大劑量組雛鴨血清DHBV DNA始終低于同期其他組，且在停藥7天時下降至最低（p<0.01）；肝康栓大、中劑量組在停藥7天后DHBV DBA均未出現(xiàn)反彈，而肝康栓小劑量組及ACV對照組均有不同程度的反彈。
　　 ③停藥7天時，肝康

14、栓大劑量組雛鴨肝組織DHBV DNA和DHBV cccDNA均受明顯抑制，結果有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　 ④與同期模型組比較，肝康栓中、大劑量組雛鴨在治療28天和停藥7天時血清ALT明顯降低，有顯著差異（p<0.01）。肝康栓大劑量組雛鴨在治療14天時血清AST也明顯降低，有顯著差異（p<0.05）；與同期ACV對照組比較，肝康栓大劑量組在給藥28天時，血清ALT明顯降低，有顯著差異（p<0.05）。停藥7天時，肝康栓

15、中、大劑量組ALT也明顯降低，有顯著差異（p<0.05）。而ACV對照組在治療過程中ALT、AST均未見顯著下降。
　　 ⑤肝組織病理檢查結果顯示：肝康栓小、中、大劑量組與模型組相比，匯管區(qū)炎性細胞浸潤和肝細胞點、灶狀壞死均有不同程度的改善。其中肝康栓大、中劑量組改善較為明顯。
　　 結論:
　　 1.本實驗成功構建了一套檢測乙型肝炎病毒基因的Taqman探針實時熒光定量PCR系統(tǒng)，并且通過方法學評價該系統(tǒng)具有

16、很好的靈敏度、特異度和可重復性。基本建立了一套較完善的抗乙型肝炎病毒藥物篩選、評價體系。
　　 2.培養(yǎng)第8～12天的HepG2.2.15細胞處于生長高峰期，在此期進行藥物實驗較適宜。肝康栓體外實驗的細胞毒性較小，并且對HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA有一定的抑制作用。
　　 3.武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨的DHBV攜帶率不高，其雛鴨DHBV自然感染率較低，適用于制備感染DHBV的

17、鴨乙型肝炎動物模型。并且在本研究中成功制備了后天感染DHBV的櫻桃谷雛鴨模型。
　　 4.肝康栓對雛鴨無明顯短期毒性作用，初步提示肝康栓作為治療慢性乙型肝炎的藥物是安全的。肝康栓能抑制模型雛鴨血清中的DHBV DNA，且存在一定的劑量和時間依賴性。肝康栓能有效抑制模型雛鴨肝組織中的DHBV DNA和DHBV cccDNA。肝康栓還能改善雛鴨的血清生化學和肝組織病理學。我們認為這些作用除了與肝康栓能有效抑制DHBV DNA的復制