中藥EHW抗乙型肝炎病毒有效組分的研究.pdf

1、目的：分離并篩選中藥EHW中的抗HBV組分，并研究其在體外的抗HBV-DNA作用，為研究和開發(fā)新的抗乙肝藥物提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用D101大孔吸附樹脂，使用乙醇-水混合流動(dòng)相分別梯度洗脫的方法分離提取中藥EHW中的有效組分；在體外采用MTT法測(cè)定E,F,E*部位以及各洗脫組分對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的抑制作用，得到各分離組段的TC50,TC0濃度。使用酶聯(lián)免疫法測(cè)定HepG2.2.15細(xì)胞在不同培養(yǎng)天數(shù)下HBsAg

2、，HBeAg的分泌情況，在分泌呈線性增長(zhǎng)的天數(shù)內(nèi)測(cè)定各分離組分在TC0濃度下對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞乙肝病毒HBsAg，HBeAg的分泌抑制作用，計(jì)算其對(duì)抗原抑制的IC50濃度，尋找其中抑制作用最佳的組分。計(jì)算各有效組分TI值，評(píng)價(jià)其治療安全性；并采用血清藥理學(xué)法測(cè)定組分F3對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞乙肝病毒HBsAg，HBeAg的分泌抑制作用；針對(duì)抑制作用較強(qiáng)的組分進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試，探討其中可能存在的各類化合物；使用PCR-熒光探針

3、法對(duì)HBsAg，HBeAg抑制作用較強(qiáng)的組分測(cè)定其對(duì)HBV-DNA的抑制作用。
　　結(jié)果：（1）本實(shí)驗(yàn)采用乙醇-水梯度洗脫D101大孔吸附樹脂的方法分離提取中藥EHW中的有效組分，分離得到部位E與部位F的10%，30%，50%，70%，100%五個(gè)濃度的乙醇洗脫段共10個(gè)組分；（2）體外抗HBV的作用：無毒濃度下中藥EHW的F，E1，E2，E5，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)5組分對(duì) HBsAg分泌均體現(xiàn)出一定的抑制作用，其中，E5、F3、

4、F5組分的抑制作用尤為顯著，其在40μg/ml濃度下作用8天對(duì)HBsAg抗原分泌的抑制率分別為71.43%,71.39%，76.89%。各有效部位抑制作用隨著藥物濃度的增加而上升，且隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)而上升；中藥 EHW F，E1， E2，E3，E4，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5組分對(duì)HBeAg的分泌都呈現(xiàn)一定的劑量依賴抑制作用，而E2，E3，E4組分抑制作用較強(qiáng)，最大抑制分別達(dá)到了80.28%，73.74%，61.88%，但只有E2,E4的抑制作

5、用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。中藥EHW各組分的提取物中，對(duì)HBeAg有效的組分中E1，E3，F(xiàn)3，F(xiàn)5的TI均比較接近，在3~6之間；E2的TI值最大，為10.61。對(duì)HBsAg有效的組分中F5組分TI較大，在4d時(shí)為12.46；F3組分的TI在5~6間且在4d即表現(xiàn)出抑制作用。F3組分對(duì)HBsAg與HBeAg均有良好抑制作用，且TI在4～5間，F(xiàn)3組分的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg，HBeAg有一定的抑制作

6、用，且抑制效果呈時(shí)間、濃度依賴性，其中10%和20%的含藥血清組與4d給藥時(shí)間的生理鹽水空白對(duì)照組比較，有顯著的差異(P<0.01)。而在給藥8d的實(shí)驗(yàn)中，各濃度含藥血清組與空白對(duì)照組相比較，均有顯著性差異（(P<0.01)。其中F3組分20%含藥血清的抑制率最高，4d和8d的抑制率分別可達(dá)到20.85%和29.70%；（3）對(duì)F3組分進(jìn)行HBV-DNA抑制試驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：F3組分對(duì) HBV-DNA表現(xiàn)出明顯的抑制作用，F(xiàn)3組分

7、的高，中，低劑量組對(duì)HBV-DNA的抑制作用與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），F(xiàn)3組分高劑量組與低劑量組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），中劑量組與低劑量組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而高劑量組與中劑量組之間的差異還有待進(jìn)一步分析（P=0.064），其化學(xué)性質(zhì)預(yù)試提示其成分為糖或苷，皂苷，蒽醌，黃酮。
　　結(jié)論：（1）中藥EHW的E1,E2,E3,E4,F3,F5組分體外均有抗HBeAg的作用，其中E1，E2，E3

8、，F(xiàn)3，F(xiàn)5治療毒性較低，其中E2，E3，E4組分效果較好；（2） E5，F(xiàn)3，F(xiàn)5組分對(duì)HBsAg分泌有較強(qiáng)抑制作用；（3）F5組分對(duì)病毒抑制較強(qiáng)但對(duì)細(xì)胞毒性也較強(qiáng)，F(xiàn)3組分是唯一對(duì)HBsAg和HBeAg同時(shí)有效且毒性較低的組分,且在血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出了一定的抑制作用，給藥8d的實(shí)驗(yàn)中，各濃度含藥血清組與空白對(duì)照組相比較，均有顯著性差異（(P<0.01)；（4）各劑量F3組分對(duì)HBV-DNA抑制有顯著性作用（P＜0.01）。本研