調(diào)控表達TNF-α抗乙型肝炎病毒研究.pdf

1、第一部分：四環(huán)素調(diào)控雙表達TNF—α載體的構(gòu)建及鑒定 目的：構(gòu)建在同一載體中可用四環(huán)素調(diào)控表達腫瘤壞死因子一α(TNF-α)的載體。 方法：以pcDNA4TM/TO為模板，用PCR法擴增含四環(huán)素調(diào)控表達序列的片段TO(位于NdeI和SacII之間)，插入pUCll8載體中測序，選擇測序正確的序列取代pVITR03載體中相應(yīng)的片段，構(gòu)建成pVITR03-TO。用相同的方法以pcDNA6/TR為模板擴增四環(huán)素阻遏蛋白基因(T

2、R)，經(jīng)測序證實后插入pVITR03-TO載體的一個多克隆位點。用相同的方法擴增TIE-α基因，經(jīng)測序證實后插入pVITR03-TO-TR載體的另外的一個多克隆位點。 結(jié)果：用PCR成功擴增出四環(huán)素調(diào)控表達序列片段、四環(huán)素阻遏蛋白基因片段和TNF-α基因片段，亞克隆后各選2個克隆測序，均找到了序列正確的克隆，經(jīng)內(nèi)切酶雙切后插入pVITR03中，完成了目的載體的構(gòu)建。 結(jié)論：成功構(gòu)建四環(huán)素雙表達調(diào)控表達TNF-u,載體(p

3、VITR03-TO-TR-TNF-α)。第二部分四環(huán)素調(diào)控雙表達TNF-α載體在真核細(xì)胞內(nèi)表達及調(diào)控 目的：研究四環(huán)素調(diào)控雙表達TNF-α載體在真核細(xì)胞內(nèi)的瞬時和穩(wěn)定表達及調(diào)控。 方法：脂質(zhì)體將TNF-α基因的四環(huán)素調(diào)控表達載體瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，以不同濃度的四環(huán)素(0,0.001，O.01，O.1，1.0，2.0μg/ml)進行誘導(dǎo)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測細(xì)胞上清中的TNF-α。觀察重組質(zhì)粒在

4、真核細(xì)胞的表達情況。脂質(zhì)體將TNF-α基因的四環(huán)素調(diào)控表達載體(pVITR03-TO-TR-TNF-α)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞，用潮霉素400μg/ml進行抗性篩選，20天形成抗性克隆，建立在四環(huán)素誘導(dǎo)下能穩(wěn)定表達TNF-α基因的細(xì)胞系。同上四環(huán)素濃度進行誘導(dǎo)，用ELISA方法檢測細(xì)胞上清中的TNF-α，以確定四環(huán)素的最佳濃度。 結(jié)果：重組質(zhì)粒能在真核細(xì)胞內(nèi)表達并進行調(diào)控。瞬時及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果都示，在無四環(huán)素環(huán)境下

5、TNF-α表達量很低，當(dāng)加入不同濃度的四環(huán)素誘導(dǎo)后，TNF-α表達量明顯增加。且四環(huán)素濃度為1.0μg/ml細(xì)胞上清中的TNF-α表達量達最高。 結(jié)論：成功的實現(xiàn)了重組質(zhì)粒的真核細(xì)胞表達及四環(huán)素對TNF-α的調(diào)控，但沒有完全實現(xiàn)精確調(diào)控，即劑量性表達。第三部分四環(huán)素調(diào)控表達的TNF-α載體的抗乙型肝炎病毒作用 目的：研究在四環(huán)素調(diào)控表達的TNF-(I基因的抗乙型肝炎病毒的作用。 方法：在第二部分確定的四環(huán)素濃度

6、(1.Oμg/m1)下誘導(dǎo)，ABBOT檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pVITR03-TOTR-TNF-α的HepG2.2.15細(xì)胞及對照組轉(zhuǎn)染了pVITR03-TOTR的HepG2.2.15細(xì)胞第1、3、5天培養(yǎng)上清中的HBsAg、HBeAg,斑點雜交及熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞第5天細(xì)胞內(nèi)及上清的HBVDNA量，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞第5天內(nèi)的HBVS基因mRNA表達。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染了pVITR03-TO-TR-TNF-α質(zhì)粒的HepG2.2.

7、15細(xì)胞，在四環(huán)素濃度(1.Oμg/m1)誘導(dǎo)下檢測對HBsAg、HBeAg均有抑制作用，抑制率在第1、3、5天分別為14.8％、11.5％、28.44％和50％、26.67％、47.85％。對照組(pVITR03-TO-TR)抑制率分別為1.2％、1.1％、0％和O.3％、1.6％、O％。斑點雜交及熒光定量PCR結(jié)果對細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中HBVDNA亦有明顯的抑制作用，抑制率分別為70.26％和79.86％。RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)H