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抗乙型肝炎病毒核酸藥物的篩選與驗(yàn)證.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、  乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染及其相關(guān)疾病嚴(yán)重影響人類(lèi)健康,同時(shí)也使患者家庭及社會(huì)承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前針對(duì) HBV 感染仍未找到可以根治的藥物。當(dāng)前臨床上廣泛使用的抗 HBV 感染藥物包括干擾素和核苷類(lèi)似物,但是這兩類(lèi)藥物都存在不同程度的副作用并且均不能徹底清除患者體內(nèi)的HBV,尤其對(duì)HBV表面抗原(hepatitis B surface protein,HBsAg)的清除作用微弱,而 HBsA

2、g的表達(dá)是造成 HBV免疫耐受的關(guān)鍵因素之一[1],因此尋找能夠抑制HBsAg的藥物將是未來(lái)抗HBV治療的重中之重。
  以生物技術(shù)藥物為主要手段的抗 HBV治療是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一,如DNA疫苗、核酶、反義核酸、RNA 干擾(RNA interference,RNAi)、抗體藥物和Dominant negative突變體(DN突變體)等。本研究就核酸技術(shù)在抗 HBV感染中的應(yīng)用進(jìn)行探討:
  目的:研究靶向c-Raf-1

3、基因反義核酸和CpG-ODN 1826體內(nèi)外抗HBV的活性,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
  方法:1. 通過(guò) HepG2.2.15 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染反義核酸藥物,在細(xì)胞水平驗(yàn)證靶向c-Raf-1基因的反義核酸藥物是否具有抗HBV活性;通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)反義核酸的毒性;通過(guò)RT-PCR檢測(cè)c-Raf-1基因mRNA水平的變化;通過(guò)HBV小鼠水動(dòng)力模型驗(yàn)證反義核酸藥物 Raf-3145體內(nèi)是否具有抗HBV活性; 2. 通過(guò)HBV小鼠水

4、動(dòng)力模型體內(nèi)評(píng)價(jià) CT102是否對(duì) HBV復(fù)制具有抑制作用,并檢測(cè) CT102是否對(duì)干擾素-α和干擾素-γ的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用;3. 通過(guò)HBV小鼠水動(dòng)力模型體內(nèi)評(píng)價(jià)CpG-ODN 1826對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果,并通過(guò)對(duì)小鼠血清中干擾素-α和干擾素-γ的檢測(cè)驗(yàn)證CpG-ODN 1826對(duì)兩者的強(qiáng)誘導(dǎo)作用。
  結(jié)果:1. 經(jīng)體外篩選,靶向c-Raf-1基因的反義核酸Raf-3145具有相對(duì)明顯的抑制 HBsAg的作用,mRNA水

5、平結(jié)果顯示 Raf-3145可劑量依賴性的抑制c-Raf-1基因的表達(dá);體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示反義核酸 Raf-3145在30 mg/kg劑量下對(duì)HBsAg的表達(dá)具有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.001),并且在該劑量下未見(jiàn)明顯的毒性; 2. 體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示CT102在腹腔注射隔天給藥12次第28天檢測(cè)時(shí)高劑量30 mg/kg可完全抑制表面抗原的表達(dá),并呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.001),中劑量10 mg/kg和低劑量 3 m

6、g/kg時(shí)呈現(xiàn)一定促進(jìn)作用(p<0.01);檢測(cè)血清中干擾素分泌結(jié)果顯示在30 mg/kg劑量下CT102對(duì)干擾素-α和干擾素-γ具有一定誘導(dǎo)作用; 3. 經(jīng)體內(nèi)驗(yàn)證,在腹腔注射隔天給藥12 次第 28 天后發(fā)現(xiàn),CpG-ODN 1826 對(duì)血清 HBsAg 和 e 抗原的表達(dá)、肝內(nèi)HBV DNA的復(fù)制和肝內(nèi)HBV核心抗原(HBcAg)的表達(dá)均具有明顯的抑制作用并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng);血清中干擾素檢測(cè)結(jié)果顯示不同劑量的CpG-ODN

7、1826對(duì)干擾素-α和干擾素-γ均具有一定誘導(dǎo)作用。
  結(jié)論:1. 經(jīng)體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)初步確定了靶向宿主基因 c-Raf-1的反義核酸Raf-3145具有一定的抑制HBsAg表達(dá)的活性,也進(jìn)一步驗(yàn)證了c-Raf-1基因可以作為抗HBV藥物設(shè)計(jì)的候選靶點(diǎn);2. CT102的抗HBV效果可能與其干擾素誘導(dǎo)作用相關(guān);3. 小鼠強(qiáng)效免疫刺激劑CpG-ODN 1826可以有效抑制HBV的復(fù)制,尤其對(duì) HBsAg 的清除作用明顯,是當(dāng)前干擾

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