乙型肝炎病毒核心蛋白區(qū)變異與隱匿性乙型肝炎病毒感染的相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)是指患者血清HBsAg陰性，肝組織HBV DNA陽性（伴或不伴有血清HBV DNA陽性）。若患者血清中HBV DNA陽性，HBV低水平復制，HBV DNA＜200IU/ml。
　　OBI不僅可以通過輸血、器官移植和透析等方式傳播HBV，而且與肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生密切相關。
　　乙型肝炎病毒核心蛋白具有

2、多種功能，在pgRNA和pol多聚酶的衣殼化、核衣殼的解離和聚合、病毒顆粒的成熟中具有重要的作用。OBI的發(fā)生與HBV的基因突變密切相關，現有的研究主要針對HBV的S區(qū)和BCP區(qū)的變異,乙型肝炎病毒核心蛋白區(qū)（C區(qū)）變異在OBI的發(fā)生發(fā)展中的作用機制目前仍不清楚。
　　研究目的：
　　探索乙型肝炎病毒核心蛋白區(qū)（C區(qū)）變異在隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)中的作用。
　　研究方法：
　　本研究通過重疊延伸PCR和

3、定點突變PCR技術構建含有不同突變位的乙型肝炎病毒核心蛋白區(qū)突變型質粒，通過細胞免疫熒光檢測肝組織HBcAg的分布情況，western blot檢測HBcAg表達水平，化學發(fā)光法檢測HBsAg和HBeAg的表達水平，免疫組織化學檢測小鼠肝組織HBcAg的表達情況，RT-PCR檢測小鼠肝組織中HBV RNA的水平。
　　實驗結果：
　　利用重疊PCR和定點突變技術成功構建單點、雙聯和三聯突變的OBI毒株和野生株。
　　H

4、BcAg在HuH7細胞有三種不同分布類型。A類包括wt、SZB、SZA-R62W、wt-P50H、wt-L55I、wt-W62R、 wt-S74G、wt-Sg7G、wt-L95I、wt-I97L、wt-T142M、wt-T147A、SZA-H50P/R62W、SZA-P50H/R62W/G74S、SZA-R62W/G748、wt-P50H/L95I;B類包括SZA、SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、

5、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T;C類包括wt-P50H/W62R、wt-P50H/W62R/S74G、wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A、wt-W62R/L95I。
　　OBI毒株SZA、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T、wt-P50H/W62R/S74G的HBcAg表達水平低于野毒株，SZA-H50P、SZ

6、A-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L的HBcAg表達水平高于SZA的HBcAg表達水平。
　　OBI毒株SZA和SZB胞內和胞外HBeAg水平低于野毒株。OBI毒株SZA的5個單點回復突變SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-R62W、SZA-G74S、SZA-I95L可輕度提高胞內和胞外HBeAg水平，SZA的4個單點回復突變SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A1

7、47T對其無明顯影響。SZA的雙聯和三聯回復突變的HBeAg表達水平要高于單點回復突變。野毒株的單點突變wt-P50H和wt-W62R可降低HBeAg水平，而雙聯突變wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I，三聯突變wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A的HBeAg表達水平低于野生型的單點突變。
　　OBI毒株SZA在Balb/c小鼠肝組織不表達HBcAg，SZB在肝組織表達HBcAg。

8、野毒株在肝組織表達HBcAg，分布類型為Ⅲ型。OBI毒株SZA的8個單點回復突變SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T不表達HBcAg。單點回復突變SZA-R62W，雙聯回復突變SZA-H50P/R62W、SZA-R62W/G74S，三聯回復突變SZA-P50H/R62W/G74S可提高HBcAg的表達水平。野毒株的單點、雙聯、三聯突變不影響HBc

9、Ag的表達水平。
　　Balb/c小鼠血清中，OBI毒株SZA的8個單點回復突變SZA-H50P、SZA-I55L、SZA-G74S、SZA-G87S、SZA-I95L、SZA-L97I、SZA-M142T、SZA-A147T的HBeAg表達水平差異不明顯，SZA的單點回復突變SZA-R62W能顯著提高HBeAg的表達水平。野毒株的單點突變wt-P50H、wt-W62R，雙聯突變wt-P50H/W62R、wt-W62R/L95I，

10、三聯突變wt-P50H/W62R/S87G、wt-P50H/W62R/T147A的HBeAg表達水平低于野毒株其它位點的單點突變。
　　第1周和第7周，SZA在小鼠肝組織始終不表達HBcAg。第1周，wt在小鼠肝臟中表達HBcAg，并且在第7周HBcAg的表達水平明顯上升。第1周，小鼠肝臟中SZA的HBV total RNA和Cregion RNA水平均低于野毒株。第七周，小鼠肝臟中SZA的HBV total RNA和C regi

11、on RNA均高于野毒株。OBI毒株SZA的HBeAg長期處于低表達水平（10-15 S/CO）。野毒株HBeAg長期處于高表達水平(500-1500 S/CO)。
　　OBI毒株的C區(qū)的P50H、W62R、S74G、S87G、L95I的聯合變異改變HBcAg、HBeAg、HBV RNA的表達水平，其中W62R起著最關鍵的作用。乙性肝炎病毒C區(qū)變異對OBI的形成具有重要作用。
　　結論：
　　OBI毒株的C區(qū)的P50H