基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標.pdf

1、目的:本課題利用人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)技術(shù)分別從靶向病毒尋找抗登革病毒靶點和靶向宿主篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標兩個方面進行探索研究。
　　方法:1.病毒靶向篩選抗登革病毒靶點:(1)構(gòu)建人工miRNA表達載體，慢病毒表達載體;(2)觀察感染登革病毒細胞的病變情況;(3) CCK-8法檢測細胞的生存率;(4)間接免疫熒光法檢測登革病毒包膜E蛋白的表達;(5)蝕斑試驗檢測細胞感染上清登革病毒的

2、滴度;(6)半定量RT-PCR法檢測細胞內(nèi)登革病毒和干擾素相關(guān)基因mRNA的表達。2.宿主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標:(1)構(gòu)建人工miRNA慢病毒表達載體;(2) ELISA法分別檢測培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg的表達;(3)熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清HBVDNA的表達;(4)嘌呤霉素篩選AFP-amiRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細胞;(5)RT-PCR法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞內(nèi)AFP mRNA的表達;(6)間接免疫熒光法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞AFP蛋白

3、的表達;(7) ELISA法定量檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞上清AFP蛋白含量。
　　結(jié)果:1.病毒靶向篩選抗登革病毒靶點:針對登革病毒保守區(qū)設(shè)計amiRNA，根據(jù)細胞病變情況初篩得到對感染DENV-2的細胞有保護作用的6條amiRNA，其中DENV-128組細胞生存率為90％，是DENV組的1.8倍，病毒包膜E蛋白的表達也大大降低;選用抗病毒效果顯著的DENV-128與其余5條有效amiRNA兩兩串聯(lián)后通過細胞病變情況觀察、CCK-8檢測、細胞

4、間接免疫熒光實驗篩選得到效果明顯的串聯(lián)序列DENV128-1382，其細胞生存率為98％，是DENV組的1.6倍，病毒包膜E蛋白的表達降低;進一步構(gòu)建并包裝表達DENV-128、DENV128-1382的慢病毒載體，通過CCK-8法檢測細胞存活率、間接免疫熒光法檢測病毒包膜E蛋白的表達情況、半定量RT-PCR檢測DENV mRNA含量、蝕斑試驗檢測感染上清液的病毒滴度、干擾素反應(yīng)檢測amiRNA是否激活內(nèi)源性干擾素反應(yīng)等實驗驗證了ami

5、RNA對登革病毒復制的特異性抑制效果。2.宿主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標:針對可能與HBV感染復制相關(guān)的33個宿主分子設(shè)計amiRNA，采用amiRNA慢病毒表達載體與HBV表達載體瞬時共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細胞，以細胞上清HBsAg和HBeAg表達水平作為評價指標篩選得到3個宿主分子（作用效率＞30％）;選擇甲胎蛋白基因(AFP)進行深入研究，針對AFP設(shè)計5條amiRNA，經(jīng)HBsAg、 HBeAg和HBV DNA檢測結(jié)果得到瞬時

6、轉(zhuǎn)染對HBV復制抑制率較高的AFP-559和AFP-1621兩條amiRNA序列，其中AFP-559對HBsAg表達抑制率為59％(96h)，對HBeAg表達抑制率為44％(96h)，對HBV DNA抑制率達40％，AFP-1621對HBsAg表達抑制率為49％(96h)，對HBeAg表達抑制率為33％(96h)，對HBV DNA抑制率達37％;然后通過包裝慢病毒建立了AFP的穩(wěn)定沉默HepG2細胞，RT-PCR、細胞間接免疫熒光及AF

7、P蛋白定量實驗顯示AFP的mRNA與蛋白表達均被顯著抑制，證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:1.針對登革病毒保守區(qū)篩選到包括DENV128在內(nèi)的6條有效amiRNA和1種amiRNA有效組合DENV128-1382，證實DENV-128和DENV128-1382能有效抑制登革病毒的復制并提高細胞存活率。2.篩選到潛在抗HBV的宿主靶標3個，并初步驗證了AFP靶點的有效性;基于amiRNA技術(shù)成功建立了AFP穩(wěn)定沉默的HepG2細胞