青蒿琥酯抗鴨乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立后天感染鴨乙型肝炎病毒(DHBV)福州麻鴨模型，制備原代鴨肝細(xì)胞，以DHBV DNA和cccDNA TaqMarl熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)法，觀察青蒿琥酯(Artesunae，ART)在體內(nèi)對(duì)DHBV DNA和DHBV cccDNA及其在原代鴨肝細(xì)胞中對(duì)DHBV DNA的抑制作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法：(1)篩選1日齡DHBV DNA(-)雛鴨，經(jīng)頸靜脈途徑接種DHBV DNA強(qiáng)陽(yáng)性

2、血清，建立福州麻鴨后天感染乙型肝炎動(dòng)物模型；將DHBV陽(yáng)性麻鴨隨機(jī)分為空白對(duì)照組、青蒿琥酯大、中、小劑量組和拉米夫定組，分別給予相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)。用藥前、用藥第7、14、21、28d及停藥第7d，取靜脈血用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清DHBV DNA含量。停藥7天后取肝組織以UNIQ-10柱式基因組DNA提取法提取肝組織內(nèi)DNA和cccDNA，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。(2)建立一種簡(jiǎn)單易行的原代鴨肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，分離雛鴨肝細(xì)胞

3、(50萬(wàn)/ml)于37℃、5％CO<,2>條件下培養(yǎng)24h存活后，隨機(jī)分為空白對(duì)照、干擾素(IFN)α-2b組和ART實(shí)驗(yàn)組，ARI、組分為15、30、60μg/ml 3個(gè)劑量濃度，每48h換藥1次，連續(xù)加藥6d，觀察細(xì)胞形態(tài)和存活情況，8d后收集細(xì)胞并測(cè)定DHBV DNA的含量。 結(jié)果：(1)拉米夫定組于用藥后，血清DHBV DNA水平迅速降低，停藥后立即反跳。青蒿琥酯大劑量組第21、28天DHBV DNA抑制率與拉米夫定組相

4、似，停藥后仍有一定的抑制作用。中、小劑量組與空白對(duì)照組比較有一定的病毒抑制作用。(2)實(shí)驗(yàn)組15、30、60μg/ml 3種濃度ART對(duì)DHBV DNA均有明顯的抑制作用，濃度越大抑制作用越明顯。3種濃度ART對(duì)鴨肝細(xì)胞無(wú)毒性，各藥物組細(xì)胞存活率均在95％以上。 結(jié)論：所建原代鴨肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易行，TaqMarl熒光定量PCR檢測(cè)方法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的DNA定量檢測(cè)技術(shù)。ART在麻鴨體內(nèi)和原代鴨肝細(xì)胞中對(duì)DHBV