RNA干擾及治療性DNA疫苗抗乙型肝炎病毒研究.pdf

1、病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。目前通常采用干擾素、核苷類似物和其它免疫調(diào)節(jié)劑等進(jìn)行乙型肝炎的治療。但由于乙肝病毒能以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的形式存在于肝細(xì)胞核內(nèi),而抗病毒治療容易引起病毒的耐藥性突變及其他的副作用,因此亟需發(fā)展新的有效的治療藥物和方法。RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為病毒性乙型肝炎的有效治療提供了一條新的思路。RNA干擾(RNA in

2、terference)是一種由雙鏈RNA誘發(fā)降解同源mRNA的基因沉默(gene silencing)現(xiàn)象。該作用除了具有高度的特異性、高效性外,人們還可以針對(duì)病毒基因保守區(qū)域選擇多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行RNAi治療,以應(yīng)對(duì)病毒變異產(chǎn)生逃避突變株,更重要的是RNAi在病毒非活躍復(fù)制期也能發(fā)揮作用?；赗NAi技術(shù)的眾多優(yōu)點(diǎn),我們對(duì)應(yīng)用RNAi進(jìn)行抗乙肝病毒治療的效果進(jìn)行了研究,從RNAi靶序列的選擇,siRNA的載體制備,它們?cè)诩?xì)胞模型和動(dòng)物體內(nèi)的

3、抑制乙肝病毒基因表達(dá)的效果,及其劑量效應(yīng),時(shí)間效應(yīng)和作用穩(wěn)定性等方面進(jìn)行了考察,希望為發(fā)展RNAi抗乙肝病毒藥物提供參考。進(jìn)一步地,我們還針對(duì)siRNA作為抗病毒藥物應(yīng)用的一個(gè)瓶頸問(wèn)題：siRNA的輸送和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)行了研究。對(duì)提高質(zhì)粒DNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和肝靶向輸送進(jìn)行了多種嘗試,獲得了有潛在應(yīng)用價(jià)值的一些前期結(jié)果。雖然siRNA的體內(nèi)輸送和轉(zhuǎn)染依然是限制RNAi相關(guān)藥物研發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題,希望我們的這些嘗試能為最終的解決方案提供一些思路

4、。最后,我們也對(duì)乙肝治療新方案中的另一條重要思路：乙肝治療性DNA疫苗的藥效進(jìn)行了研究。我們實(shí)驗(yàn)室在前期工作中,發(fā)展了DNA疫苗的電導(dǎo)入技術(shù),免疫健康小鼠和恒河猴模型后,產(chǎn)生了快速和強(qiáng)烈的體液和細(xì)胞免疫。在本論文工作中,我們進(jìn)一步地驗(yàn)證了產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對(duì)病毒蛋白的清除作用,我們分別使用模擬乙肝病毒感染的小鼠(尾靜脈高壓注射乙肝表面蛋白表達(dá)質(zhì)粒)和感染乙肝病毒的狒狒(baboon)作為動(dòng)物模型,觀察電導(dǎo)入DNA疫苗后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答情況及對(duì)

5、乙肝病毒的清除情況,為治療性疫苗的臨床研究提供了重要的支持。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果總結(jié)如下：1.我們根據(jù)國(guó)內(nèi)乙肝病毒流行的情況和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛_定了研究用乙肝病毒的亞型并通過(guò)測(cè)序確定了基因序列,根據(jù)RNAi干擾作用的特點(diǎn)在乙肝病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄和分泌過(guò)程中發(fā)揮重要作用的表面蛋白編碼區(qū)-S區(qū)選擇了三段序列作為RNAi作用靶點(diǎn),經(jīng)BLAST驗(yàn)證與其它基因無(wú)明顯同源性后針對(duì)這三個(gè)靶點(diǎn)用化學(xué)合成法制備了siRNA和化學(xué)修飾(其中對(duì)A,U堿基甲基化修飾)的s

6、iRNA,同時(shí)我們也設(shè)計(jì)了用于siRNA表達(dá)載體構(gòu)建的DNA插入片段,并將其克隆到帶人U6啟動(dòng)子的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體上,經(jīng)酶切及測(cè)序驗(yàn)證后大提純化以用于細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。2.我們用細(xì)胞模型研究了siRNA對(duì)HBV抗原基因復(fù)制和表達(dá)的影響。我們首先將siRNA、甲基化修飾siRNA或shRNA表達(dá)質(zhì)粒與乙型肝炎病毒表面抗原真核表達(dá)質(zhì)粒(pHBS)共轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞,結(jié)果表明針對(duì)S區(qū)基因篩選和合成的siRNA都能在肝細(xì)胞中明顯降解靶基因

7、mRNA,減少表面抗原的形成(抑制率達(dá)到80-90%),同時(shí)它們的作用隨著劑量的增加而加強(qiáng),針對(duì)三個(gè)靶點(diǎn)的siRNA同時(shí)使用也可以一定程度上增強(qiáng)對(duì)表面抗原合成的抑制作用。不過(guò)三種形態(tài)的siRNA的作用和動(dòng)力學(xué)特征有所不同,其中siRNA作用較強(qiáng)但作用維持時(shí)間較短；甲基化修飾一定程度上影響了siRNA的干擾作用,但另一方面也增加了siRNA的穩(wěn)定性,延長(zhǎng)了干擾作用的時(shí)間；而shRNA表達(dá)質(zhì)粒的作用與siRNA相似,但它的作用時(shí)間明顯比si

8、RNA和甲基化修飾的siRNA長(zhǎng)。在利用HepG2.2.15細(xì)胞模型進(jìn)行siRNA對(duì)乙肝病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄影響的研究中,我們證實(shí)siRNA能夠明顯地降低細(xì)胞和培養(yǎng)液中的乙肝病毒DNA和表面抗原的水平,抑制率可以達(dá)到60%以上(不考慮已經(jīng)存在的病毒DNA和蛋白及細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率),而且我們發(fā)現(xiàn)siRNA在對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中對(duì)乙肝病毒的抑制具有劑量效應(yīng),甲基化修飾siRNA對(duì)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的抑制作用雖然略低于siRNA,但能夠持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)

9、間。3.在證明siRNA可以在體外有效的干擾乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制后,我們研究了不同結(jié)構(gòu)的siRNA在小鼠肝臟內(nèi)對(duì)乙肝表面抗原表達(dá)的抑制作用和特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與pHBS共轉(zhuǎn)染的不同形態(tài)的siRNA都能夠明顯降低表面抗原mRNA的水平并減少蛋白的生成,它們的作用同樣表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。siRNA的作用在三天以后明顯降低,甲基化修飾siRNA的作用能夠維持相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間,但在第五至七天也基本消失,而shRNA表達(dá)質(zhì)粒的作用是最穩(wěn)定的,在第十一天依然

10、能抑制50-60%的抗原表達(dá),在注射后三十天還能檢測(cè)到它對(duì)乙肝蛋白形成的抑制。siRNA不僅能夠抑制與之共轉(zhuǎn)染的pHBS的轉(zhuǎn)錄,對(duì)預(yù)先在小鼠肝臟中存在并表達(dá)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄也有抑制作用,不考慮已經(jīng)存在于肝細(xì)胞中的蛋白及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,siRNA在第一天就可以抑制60%的蛋白生成,第二天達(dá)到80%左右,表面抗原在血液中滴度的降低更加明顯,到第二天已基本檢測(cè)不到抗原的存在。另外我們還發(fā)現(xiàn)siRNA可以使乙肝表面抗原的形成量降低到不足以在體內(nèi)誘導(dǎo)

11、相應(yīng)抗體的產(chǎn)生。4.siRNA的體內(nèi)靶向輸送是其用于抗病毒治療的一個(gè)主要障礙,在體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體結(jié)合DNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15的效果不好,而在體內(nèi)尾靜脈注射后則基本看不到效果。為了提高脂質(zhì)體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)輸送和轉(zhuǎn)染的效率,我們進(jìn)行了一系列的嘗試。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體包裹密度較大的釓噴酸葡胺或碘海醇溶液可以明顯提高質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(5倍到25倍),但碘海醇脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性明顯低于釓噴酸葡胺脂質(zhì)體。另外我們嘗試了使用

12、不同的物理化學(xué)輸送方法,包括Hydrodynamic注射,含氣脂質(zhì)體超聲輸送,肝臟介入,肝臟直接注射及電轉(zhuǎn)染和多室脂質(zhì)體載體等用于小鼠肝靶向DNA輸送,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用含氣脂質(zhì)體,多室脂質(zhì)體,肝臟介入,肝臟直接注射及電轉(zhuǎn)染等方法都可以一定程度的提高質(zhì)粒DNA的針對(duì)肝細(xì)胞的靶向輸送,但轉(zhuǎn)染效率的提高并不明顯。而Hydrodynamic注射可以非常高效率的將質(zhì)粒DNA特異的輸送到肝臟,但該方法無(wú)法用于臨床,因此還需要尋找其它高效的肝靶向si

13、RNA輸送方法。5.我們將乙肝表面抗原表達(dá)質(zhì)粒(pHBS)作為HBV-DNA疫苗研究了在電轉(zhuǎn)染作用下在小鼠體內(nèi)的免疫誘導(dǎo)情況并對(duì)模擬急性感染的乙肝病毒的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給小鼠注射5μg的表面抗原表達(dá)質(zhì)粒并給予電脈沖刺激能夠明顯提高表面抗原誘導(dǎo)的體液免疫并使產(chǎn)生的抗體更快的達(dá)到保護(hù)水平,而且作為主要細(xì)胞免疫應(yīng)答代表的IFN-γ的水平也明顯比對(duì)照組高。在小鼠產(chǎn)生抗體以后,經(jīng)尾靜脈高壓注射乙肝表面抗原表達(dá)質(zhì)粒模擬病毒感染,結(jié)果顯示經(jīng)質(zhì)粒

14、電轉(zhuǎn)染免疫的小鼠其肝內(nèi)的表面抗原的最高水平只有對(duì)照組的10%左右,而且在第三天就已經(jīng)檢測(cè)不到；血液中表面抗原的變化更加明顯,在注射抗原表達(dá)質(zhì)粒12小時(shí)后根本檢測(cè)不到表面抗原的存在,既便是在對(duì)照組抗原表達(dá)達(dá)到高峰的24小時(shí),其血液依然為HBsAg陰性。免疫組化結(jié)果證明肝臟中表面抗原陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及表面抗原的水平明顯低于對(duì)照組。HE染色發(fā)現(xiàn)肝組織沒(méi)有明顯的壞死和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),而且免疫組和對(duì)照組的ALT水平也沒(méi)有顯著性的差異,表明細(xì)胞免疫對(duì)抗