重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RNA干擾對乙型肝炎病毒復(fù)制和表達(dá)的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個非常嚴(yán)重的全球性的公共衛(wèi)生問題，全世界約3.5億人為慢性HBV感染者，每年全球大約有100萬人死于與HBV感染相關(guān)的疾病，包括肝炎(Hepatitis)、肝硬化(Cirrhosis)、肝衰竭（Hepatic failure）和肝細(xì)胞癌(HCC)。目前對HBV感染的主要治療手段包括干擾素、核苷及核苷酸類似物等，但是這些藥物只能在少數(shù)慢性感染患者中能產(chǎn)生長期應(yīng)答，并不能徹底清除乙肝病毒，并且也存在著治療后復(fù)發(fā)

2、率高、藥物毒副作用較大和藥品價格昂貴等問題，因此，必須尋找更有效的治療手段。
　　RNA干擾技術(shù)(RNAi)即將與其目的基因同源的小分子雙鏈(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致目的mRNA降解，從而阻斷真核細(xì)胞中相應(yīng)基因產(chǎn)物的表達(dá)，它具有抑制效率高、特異性強、細(xì)胞較容易攝取等優(yōu)點，成為一種新的分子生物學(xué)技術(shù)。但同時也存在作用時間短暫等不足。
　　為解決這一問題，本實驗采用腺相關(guān)病毒作為載體，利用它具有高穩(wěn)定性、高靶向性、低致病性、

3、低免疫原性、宿主范圍廣泛、可長期表達(dá)等優(yōu)點，作為抗HBV的shRNA表達(dá)框的載體，轉(zhuǎn)染含HBV病毒全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞，觀察對HBV復(fù)制和表達(dá)的抑制作用，嘗試解決RNAi技術(shù)抗HBV作用時間短暫的問題。
　　本研究將hu6驅(qū)動的shRNA表達(dá)框置于腺相關(guān)病毒(AAV)的兩個ITR(ITR)之間，之后接有HBV的基本核心啟動子(BCP)及其驅(qū)動AAV的Rep基因，由此構(gòu)成rAAV，作為抗HBV的shRNA表達(dá)框的質(zhì)粒載

4、體，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞（乙肝病毒基因插入肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞中），測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg表達(dá)及HBV DNA拷貝數(shù)，并對細(xì)胞基因組AAVS1區(qū)域進(jìn)行測序。經(jīng)檢測表明，成功構(gòu)建了含目的序列的rAAV質(zhì)粒載體PLRBR322-324、 PLRBR522-324、 PLRBR322-2424、PLRBR522-2424。體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實驗顯示四個載體對HBsAg、HBeAg表達(dá)及H

5、BV DNA復(fù)制都有抑制效應(yīng)，且前兩者對HBsAg更高、后兩者對HBeAg更高，第三個對HBV DNA拷貝數(shù)更高。轉(zhuǎn)染后第3天后抑制效應(yīng)最明顯，第10天抑制率仍較高。針對細(xì)胞基因組AAVS1區(qū)域測序結(jié)果顯示，目的序列定點整合于該區(qū)域。
　　以上結(jié)果表明，利用AAV和HBV各種元件構(gòu)建的rAAV,作為抗HBV的shRNA表達(dá)框的載體，借助Rep蛋白介導(dǎo)的定點整合作用，為解決RNAi抗HBV作用時間短暫的問題做了一些技術(shù)上的探索。