esiRNA抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的研究.pdf

1、RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指雙鏈RNA特異性地誘發(fā)與其序列同源的mRNA分子被降解，從而抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，是一種特殊的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默(posttranscriptionalgenesilence，PTGS)現(xiàn)象。近年來在細(xì)胞和動(dòng)物體系中利用小干擾RNA(smallinterferenceRNA，siRNA)進(jìn)行的抗腫瘤和抗病毒等的應(yīng)用研究表明，RNA干擾技術(shù)在疾病治療領(lǐng)域具有誘人的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室曾

2、報(bào)道利用大腸桿菌發(fā)酵制備esiRNA(endoribonuclease-preparedsiRNAs)，并利用其在細(xì)胞體系中高效特異地抑制了乙型肝炎病毒的復(fù)制。本論文首先在以前的工作基礎(chǔ)上改進(jìn)了在大腸桿菌中表達(dá)雙鏈RNA的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，提高了雙鏈RNA的產(chǎn)量：進(jìn)一步我們針對(duì)乙型肝炎病毒的不同基因制備了四種esiRNA，通過實(shí)驗(yàn)篩選出具有最佳抑制效率的esiHBVP，并且證明esiHBVP對(duì)乙型肝炎病毒的抑制效率高于化學(xué)合成的小干擾

3、RNA；最后通過實(shí)驗(yàn)我們還證明了來自C型乙型肝炎病毒的esiHBVP能夠高效抑制靶序列不完全一致的報(bào)告基因的表達(dá)，來自B型乙型肝炎病毒的esiHP9同樣可以高效特異地抑制靶序列一致性為87％的C型乙型肝炎病毒的復(fù)制。結(jié)果顯示esiRNA可以耐受一定程度的靶序列變異而不影響其抑制效率，我們推測(cè)esiHBVP能夠抑制在中國人群中占主導(dǎo)地位的B型和C型乙型肝炎病毒的復(fù)制。 論文第一章的工作中，改進(jìn)了在大腸桿菌中生產(chǎn)雙鏈RNA的表達(dá)載體

4、的構(gòu)建方法以及es'tRNA的純化方法，在細(xì)胞體系中證明了利用這種方法純化得到的esiRNA不激活干擾素途徑，不引起非特異性基因表達(dá)的抑制。首先構(gòu)建了一個(gè)帶有間隔序列的表達(dá)載體，然后將目的基因分別以正向和反向連接到間隔序列的兩側(cè)，使得目的基因的正反義鏈在同一強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄，互補(bǔ)配對(duì)后形成雙鏈RNA。構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)雙鏈RNA，與雙啟動(dòng)子表達(dá)載體相比，雙鏈RNA的得率提高了約5倍。利用大腸桿菌RNaseⅡI對(duì)雙

5、鏈RNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物通過離子交換層析和分子篩層析分離純化，最終得到21bp左右的esiRNA。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示esiRNA可以高效特異地抑制目的基因的表達(dá)。 第二章的工作中，證明了esiRNA比化學(xué)合成的siRNA能夠更加高效地抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制。針對(duì)HBV的不同ORF制備了4種esiRNA，在HepG2細(xì)胞中篩選出對(duì)HBV抑制效率最高的esiRNA—esiHBVP，并且檢測(cè)了esiHBVP在動(dòng)物體系中對(duì)HBV的抑制情

6、況。然后合成了一段文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)HBV抑制效率最好的siRNA，在細(xì)胞體系中比較了esiHBVP和合成的siRNA對(duì)靶基因表達(dá)的抑制情況，同時(shí)在動(dòng)物體系中比較了esiHBVP和合成的siRNA對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的抑制情況。在CHO細(xì)胞中，48小時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示esiHBVP對(duì)報(bào)告基因HBsAg表達(dá)的抑制作用高于合成的siRNA。通過尾靜脈液壓法給藥esiHBVP和合成的siRNA，觀察它們對(duì)乙型肝炎病毒在ICR小鼠肝臟內(nèi)復(fù)制的抑制作用，與

7、沒有注射小干擾RNA的對(duì)照小鼠相比，兩種siRNA處理的小鼠肝臟內(nèi)的乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原、C抗原的表達(dá)水平均被抑制，esiHBVP的抑制效率高于合成的siRNA。注射后的第一天，esiHBVP和合成的siRNA對(duì)HBsAg的抑制率分別為90％和33％，對(duì)HBeAg的抑制率分別是89％和45％。在第四天，與沒有注射小干擾RNA的對(duì)照小鼠相比，1μgesiHBVP處理過的小鼠血清中的病毒DNA拷貝數(shù)下調(diào)了82％，而1μgsiRNA處

8、理過的小鼠血清中的病毒DNA拷貝數(shù)僅下調(diào)了37％。結(jié)果表明，與合成的siRNA相比，esiHBVP在抑制效率和持續(xù)時(shí)間方面均顯示出明顯的優(yōu)越性。 第三章的工作中，從血清中擴(kuò)增HBVP基因片段，將這些具有不同程度序列一致性的HBVP片段構(gòu)建到報(bào)告基因的3’非翻譯區(qū)，作為esiHBVP作用的靶序列，在CHO細(xì)胞中檢測(cè)esiHBVP對(duì)它們的抑制情況。結(jié)果表明esiHBVP可以同樣高效特異性地抑制含有不同程度變異的靶序列的報(bào)告基因的表達(dá)

9、。在此基礎(chǔ)上，我們制備了和HBVP序列差異最大的片段HP9對(duì)應(yīng)的esiRNA--esiHP9，分別在細(xì)胞體系和動(dòng)物體系中檢測(cè)了esiHP9對(duì)與其序列一致性為87％的乙型肝炎病毒的抑制情況。在HepG2細(xì)胞中，esiHP9能夠劑量依賴性地抑制乙型肝炎病毒表面抗原的分泌表達(dá)，在用量為150ng時(shí)，esiHP9達(dá)到和esiHBVP基本一致的抑制效率。在單次轉(zhuǎn)染150ngesiHP9后，抑制率在以后的7天內(nèi)維持在80％左右。通過尾靜脈液壓法給藥