MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒基因復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可引起慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌嚴(yán)重危害人類健康，是醫(yī)學(xué)界多年來(lái)致力攻關(guān)的一個(gè)難題。α-干擾素(Interferon alpha，IFN-α)是目前少數(shù)臨床治療乙型肝炎有效的藥物之一，但對(duì)其抗病毒機(jī)制尚未完全明了。本室前期研究結(jié)果表明，IFN-α誘生的髓樣細(xì)胞分化蛋白(MyD88)可發(fā)揮抗HBV復(fù)制的作用，可導(dǎo)致細(xì)胞總成分和胞漿中的HBVRNA水平顯著下調(diào)，提示在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)

2、控HBV的復(fù)制。 目前已知，MyD88蛋白是Toll樣受體、白介素-1受體、白介素-18受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，可通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)最終引起核因子kappa B(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)依賴性信號(hào)通路的活化。 已有研究表明，部分細(xì)胞因子以及干擾素誘生的抗病毒蛋白可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HBV的基因復(fù)制和表達(dá)，機(jī)理涉及對(duì)HBV RNA核外運(yùn)輸以及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，但尚不清楚IFN-α誘生的My

3、D88蛋白是否以同類機(jī)制在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HBV的基因復(fù)制。本課題擬從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控兩方面探討MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制。 為探討MyD88蛋白介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)系統(tǒng)活化在抗HBV效應(yīng)中的作用，首先構(gòu)建了MyD88的截短突變體，然后與HBV復(fù)制型質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，研究它們對(duì)HBV復(fù)制的影響。 結(jié)果證實(shí)，MyD88全長(zhǎng)蛋白、及其兩個(gè)截短突變體M(1-151)、M(151-296)活化NF

4、-κB的程度不同，并與抑制HBV蛋白以及復(fù)制中間體DNA合成的水平相一致，提示MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制的效應(yīng)與MyD88激活NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。進(jìn)一步以NF-κB的超抑制劑(super-repressor)IkBa-SR抑制NF-κB信號(hào)通路，研究NF-κB信號(hào)通路在MyD88拮抗HBV效應(yīng)中的作用。 結(jié)果顯示，與空載相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染MyD88和HBV的細(xì)胞中HBV core蛋白的合成顯著降低；而當(dāng)加入IκBα-SR共同瞬

5、轉(zhuǎn)后細(xì)胞中core蛋白的表達(dá)量顯著增加。檢測(cè)HBeAg和HBsAg以及HBV復(fù)制中間體DNA，得到相似結(jié)果，上述結(jié)果提示MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制的效應(yīng)依賴于NF-κB信號(hào)通路的活化。 進(jìn)一步將HBV的復(fù)制型質(zhì)粒與NF-κB信號(hào)通路激活劑-IKKα/IKKβ表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IKKα/IKKβ在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)后可顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg和HBsAg和復(fù)制中間體DNA的合成，并呈劑量依賴關(guān)系。

6、同時(shí)將HBV復(fù)制型質(zhì)粒和IKKα/IKKβ、MyD88、IκBα-SR 分別或共同轉(zhuǎn)染后檢測(cè)HBV RNA的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染IKKα/IKKβ或MyD88均可抑制HBV在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄；而IκBα-SR轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBV RNA轉(zhuǎn)錄體水平則上調(diào)。以上結(jié)果提示，NF-κB信號(hào)通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。此外，為排除p38 MAPK或ERK1/2活化在MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制中的作用，在MyD88與HBV復(fù)

7、制型質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞時(shí)加入SB20538或PD98059以抑制p38 MAPK或ERK1/2的活化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白抑制HBV的效應(yīng)在抑制劑處理組與非處理組間無(wú)顯著差異，提示MyD88蛋白調(diào)控HBV復(fù)制不依賴p38和ERK1/2信號(hào)通路的活化。為進(jìn)一步探討MyD88蛋白在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控HBV復(fù)制的機(jī)理。首先采用HBV啟動(dòng)子控制下的報(bào)告基因，檢測(cè)MyD88蛋白對(duì)HBV啟動(dòng)子的活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyD88蛋白對(duì)H

8、BV啟動(dòng)子活性無(wú)顯著影響，排除了MyD88蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)乙肝病毒啟動(dòng)子活性抑制HBV轉(zhuǎn)錄激活的可能性。進(jìn)一步在Huh7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV復(fù)制型質(zhì)粒和MyD88表達(dá)質(zhì)粒，分離細(xì)胞核與細(xì)胞漿中的HBVRNA，用RNA slot和real-time PCR分析HBV RNA在兩者中的分布。 結(jié)果顯示，表達(dá)MyD88蛋白可同時(shí)下調(diào)細(xì)胞核與細(xì)胞漿中HBV mRNA的水平，但HBVRNA的核/漿比值增加了了2～3倍，提示MyD88蛋白有可能

9、通過(guò)改變HBV RNA的核、漿分布比例從而影響HBV的基因復(fù)制。進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件PRE(posttranscriptional regulate element)調(diào)控下的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)道系統(tǒng)分析MyD88蛋白將HBV RNA滯留于細(xì)胞核內(nèi)的可能機(jī)理。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MyD88穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中報(bào)道基因CAT的表達(dá)水平顯著降低；在Huh7細(xì)胞中采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式也證明MyD88蛋白可特異性地抑制報(bào)道基因的表達(dá)，提示

10、MyD88蛋白影響PRE序列介導(dǎo)的HBV mRNA的核外運(yùn)輸過(guò)程。另外，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染MyD88后HBV RNA的半衰期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MyD88蛋白可降低HBVRNA的穩(wěn)定性。 以上研究結(jié)果提示，MyD88蛋白可能通過(guò)影響PRE序列介導(dǎo)的HBV mRNA的核外運(yùn)輸過(guò)程、降低HBV RNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控HBV的復(fù)制。 綜上所述，在本室前期研究發(fā)現(xiàn)IFN-α誘生的髓樣細(xì)胞分化蛋白(MyD88)可發(fā)揮抗HBV復(fù)制作用的基礎(chǔ)上，本

11、研究進(jìn)一步證實(shí)NF-κB信號(hào)通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而MyD88蛋白可能通過(guò)影響PRE序列介導(dǎo)的HBV mRNA的核外運(yùn)輸過(guò)程、降低HBV RNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控HBV的復(fù)制。以上發(fā)現(xiàn)豐富了對(duì)干擾素誘生的MyD88蛋白抑制HBV復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識(shí)。從多角度深入探討MyD88蛋白調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制，可有利于加深對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及細(xì)胞基因功能等的認(rèn)識(shí)，揭示病毒和宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)理，并可為臨床治療