IFN-α與IFN-γ聯(lián)合誘導(dǎo)表達(dá)的MAX蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制機(jī)制的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染引起的肝炎、肝硬化、甚至肝癌嚴(yán)重危害人類健康，但迄今無有效的治療方法。α伐干擾素(Ⅰ型干擾素)在臨床用于治療乙型肝炎已有20多年的應(yīng)用歷史，但是有效率只有30-40﹪。γ干擾素(Ⅱ型干擾素)則是一類主要在免疫細(xì)胞中合成、可通過免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)的細(xì)胞因子。已有研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用Ⅰ型和Ⅱ型干擾素可以上調(diào)ISGF3復(fù)合物的活性；也有研究報(bào)道聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)對單純皰疹病毒、丙型肝炎

2、病毒、鼠肝炎病毒和SARS病毒復(fù)制的抑制作用。本課題組用I型和II型干擾素聯(lián)合處理肝源性細(xì)胞(Huh7)也發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制。 為了探索聯(lián)合應(yīng)用干擾素增加抗病毒作用的機(jī)制，將人肝源性細(xì)胞(Huh7)分別用α和Y干擾素聯(lián)合及單獨(dú)處理6h后抽提細(xì)胞RNA，用基因芯片(HGU—133A，Affymetrix公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將雜交信號掃描后處理分析。根據(jù)已知的干擾素信號通路以及抗病毒蛋白，本實(shí)驗(yàn)將Log2C—MAX(Log

3、2A,B)≥03c：聯(lián)合應(yīng)用IFN-a和IFN-7處理組與對照組的基因變化譜；A，B：單獨(dú)應(yīng)用IFN-a或IFN-y處理組與對照組的基因變化譜)的基因進(jìn)行歸類和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用干擾素相比，聯(lián)合處理組共有137個(gè)基因在早期得到了增強(qiáng)，其中20個(gè)基因與抗病毒／免疫相關(guān)，26個(gè)基因與信號通路相關(guān)，23個(gè)基因與RNA相關(guān)，15個(gè)與蛋白折疊和降解相關(guān)，24個(gè)與細(xì)胞凋亡黏附等相關(guān)。有意義的是，除了許多己知的干擾素信號通路基因(JAK2、S

4、TATl和STAT2等)和抗病毒基因(ISGl5、OASL和ISG20等)得到增強(qiáng)外，還發(fā)現(xiàn)許多未報(bào)道可被干擾素誘導(dǎo)基因(MAX、Bcl-G等)的表達(dá)也得到了增強(qiáng)。挑選了部分基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片一致，證實(shí)基因表達(dá)譜結(jié)果的可靠性。 挑選部分聯(lián)合誘導(dǎo)表達(dá)基因克隆入真核表達(dá)載體得pcDNA-MAX和pcDNA-UBE2L6質(zhì)粒，分別與HBV復(fù)制型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAX可抑制HBsAg和HBeAg的表達(dá)。

5、MAX屬于bHLHZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可以形成同源二聚體或者異源二聚體，c-Myc必須通過E-box與MAX形成異源二聚體c-Myc-MAX從而激活細(xì)胞增殖和凋亡。其他的成員如Mad、Mxi—l和Mnt也可以與MAX形成異源二聚體對抗調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。但是有關(guān)MAX蛋白在干擾素通路和抑制病毒復(fù)制方麗的研究尚未見報(bào)道。為了探討MAX在干擾素抑制HBV中的作用，進(jìn)一步將MAX蛋白表達(dá)質(zhì)粒與HBV復(fù)制型質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，檢測其對HBV基因復(fù)制

6、和表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：與空載質(zhì)粒的對照組相比，當(dāng)MAX蛋白表達(dá)質(zhì)粒分別以0.125、0.25、0.5μg與0.5μgHBV復(fù)制型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞上清中HBsAg分別降低了19﹪、36﹪和61﹪，HBeAg分別降低了23﹪、37﹪和53﹪；抽提細(xì)胞內(nèi)的HBVcoreparticleDNA，Real-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)HBVDNA分別降低了28﹪、52﹪和80﹪。當(dāng)MAX轉(zhuǎn)染劑量分別為1.25μg、2.5μg，HBV復(fù)制型質(zhì)粒為

7、5μg時(shí)，Southernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示coreparticle中HBVDNA分別下降了60﹪和65﹪。當(dāng)MAX轉(zhuǎn)染劑量分別為0．25μg、0.5μg、1μg，HBV復(fù)制型質(zhì)粒為1μg時(shí)，HBVRNA在Northernblot實(shí)驗(yàn)中分別下降了30﹪、70﹪和80﹪。上述結(jié)果提示MAX蛋白可以抑制HBV蛋白的合成、基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。此外，對ISRE的活性檢測提示發(fā)現(xiàn)MAX調(diào)節(jié)干擾素信號通路發(fā)揮抗病毒作用。 上述研究結(jié)果為進(jìn)一