重組人IFN-γ誘導(dǎo)自身免疫性疾病機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的：在分離純化B細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察不同來源的B細(xì)胞（臍帶血來源和外周血來源，分別作為B1和B2細(xì)胞來源）分別經(jīng)LPS、IFN—γ兩種因子刺激培養(yǎng)后，在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)的改變；運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況的差異；ELISA法檢測(cè)IgM、IgG兩種免疫球蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化，從而探討IFN—γ是否能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化、巨噬細(xì)胞化、產(chǎn)生抗體。通過比較IFN—γ對(duì)健康人外周血與臍帶血中B細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的異同，并將其作用與LPS的刺激作

2、用相比較，探討IFN—γ對(duì)人外周血和臍帶血中B細(xì)胞形態(tài)和抗體產(chǎn)生的影響及其作用模式與胸腺非依賴性抗原（TI抗原）的異同。初探IFN—γ是否通過影響CD5+B1細(xì)胞的形態(tài)和功能而誘發(fā)自身免疫性疾病，為進(jìn)一步闡明IFN—γ誘發(fā)自身免疫性疾病的機(jī)制、研究自身免疫性疾病的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①分離純化B細(xì)胞：無菌采集20例健康人外周血、臍帶血各40ml，每組分別加入RosetteSepTM試劑2．0 ml，室溫孵育20min，

3、加入等體積的含20ml/L FBS的PBS進(jìn)行稀釋，輕柔混勻，小心鋪加于Ficoll液之上，離心后吸取位于Ficoll液和血漿層之間的富集細(xì)胞層細(xì)胞。用含20ml/L FBS的PBS洗滌細(xì)胞三次，最終收集細(xì)胞懸液約2 ml；將收集到的細(xì)胞懸液置于小玻璃平皿中，37℃靜置30min以去除單核細(xì)胞，收集上清即為B細(xì)胞懸液。②細(xì)胞培養(yǎng)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞純度，計(jì)數(shù)用1640培養(yǎng)液調(diào)至濃度約1．5×106個(gè)細(xì)胞/ml，加至96孔培養(yǎng)板，每板設(shè)

4、兩個(gè)大組，分別為：外周血B細(xì)胞組和臍帶血B細(xì)胞組，每個(gè)大組分別設(shè)三個(gè)小組，分別為：空白組、IFN—γ（100u/ml）組、LPS（10ug/ml）組，每小組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)的第3、5、7d分別收集培養(yǎng)上清液，每孔收集約150ul于eppend of管，置—80℃冰箱保存待用。③細(xì)胞形態(tài)的觀察：分別于培養(yǎng)的第3、5、7d將每孔收集完細(xì)胞培養(yǎng)上清液后沉淀的細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。④細(xì)胞活性與增殖情況的檢測(cè)：分別在培養(yǎng)

5、的第1、3、5、7d運(yùn)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性及吸光度值。⑤抗體含量的檢測(cè)：將培養(yǎng)的第3、5、7d收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液運(yùn)用ELISA（enzymelinked immunosorbent assay酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）檢測(cè)各孔中IgG、IgM的含量。⑥運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件將所得的OD值及抗體的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，最終獲得的B細(xì)胞純度為81．4%，人外周血、臍帶血B細(xì)胞經(jīng)IFN—γ和LPS刺激后，于第3d形態(tài)

6、開始有所改變——逐步轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，且總細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸增多，但沒有發(fā)現(xiàn)有巨噬細(xì)胞樣改變。⑴在同一時(shí)間段、同一刺激因子的作用下外周血與臍帶血來源B細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后所產(chǎn)生IgM的量、細(xì)胞的增殖程度（OD值）的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）；且B細(xì)胞的形態(tài)改變也未見差異；⑵在血液來源相同、同一刺激因子作用下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生IgM的量、細(xì)胞增殖程度逐步增加，三個(gè)時(shí)間段產(chǎn)生IgM的量、細(xì)胞增殖程度進(jìn)行兩兩比較的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．

7、0001、P=0．0030、P=0．0020、P=0．0010）；⑶在相同時(shí)間段、血液來源相同的情況下經(jīng)LPS刺激后產(chǎn)生IgM的量比IFN—γ刺激后產(chǎn)生IgM的量多，它們之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．001、P=0．002、P=0．003、P<0．0001，）；LPS刺激外周血B細(xì)胞組與IFN—γ刺激外周血B細(xì)胞相比細(xì)胞數(shù)目明顯增多，兩者之間MTT檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且分別與空白組的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．0001或P=

8、0．001）；LPS刺激臍帶血B細(xì)胞組與IFN—γ刺激臍帶血B細(xì)胞組MTT檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別與空白組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．0030或P=0．001、P<0．0001）；所有實(shí)驗(yàn)組均未檢測(cè)到IgG，空白對(duì)照組未檢測(cè)到IgM、IgG。 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)中B細(xì)胞在IFN—γ的刺激作用下逐步向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但未產(chǎn)生巨噬細(xì)胞樣改變，說明其沒有通過加強(qiáng)抗原提呈影響到B細(xì)胞的免疫應(yīng)答。②IFN—γ能夠刺激B細(xì)胞活化、增殖，