HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ的機制研究.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）屬于黃病毒科肝炎病毒屬。盡管機體免疫系統(tǒng)通過多種途徑識別并清除 HCV及病毒蛋白，但仍有部分患者在急性感染期不能有效清除病毒，發(fā)展為慢性感染，提示 HCV可通過多種機制來逃逸宿主的免疫攻擊。HCV核心蛋白不僅構(gòu)成病毒核衣殼、參與病毒復(fù)制和組裝，還與免疫細胞表面或者胞內(nèi)蛋白相互作用，誘導(dǎo)馴化免疫細胞，為其提供合適的生存環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，HCV核心蛋白與補體受體（globula

2、r heads of C1q receptor， gC1qR）結(jié)合，不僅抑制 IL-12產(chǎn)生，還干擾 T細胞受體（Tcell receptor， TCR）活化信號通路，抑制抗病毒免疫應(yīng)答；或者通過與JAK/STAT信號通路的多種成分相互作用，影響 IFN-α的產(chǎn)生，從而抑制抗病毒基因干擾素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）的活化。
　　單核/巨噬細胞是機體發(fā)揮抗感染的第一道防線，其中單核細

3、胞約占外周血單個核細胞（ peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的1-6％，趨化至肝內(nèi)感染部位，分化為巨噬細胞和枯否氏細胞。大量研究結(jié)果表明，單核/巨噬細胞在 HCV感染后的疾病進程中發(fā)揮重要作用。在HCV感染機體早期，單核/巨噬細胞可輔助HCV病毒的復(fù)制和持續(xù)感染的建立。Gyongyi Szabo等對慢性 HCV感染患者的肝組織進行病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)大量活化的巨噬細胞浸潤。本室前期研究發(fā)現(xiàn)

4、 HCV核心蛋白、肝細胞共同作用可使巨噬細胞表達M2型分子CD206升高。同時后續(xù)實驗證明了 HCV核心蛋白通過與巨噬細胞表面補體受體gC1qR結(jié)合，誘導(dǎo)負調(diào)控因子 A20高表達及炎癥因子的低度分泌。因此，本研究擬通過檢測胞內(nèi)信號通路間相互作用觀察 HCV核心蛋白對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌 IFN-γ的影響，并初步探討其機制，為進一步系統(tǒng)闡述HCV核心蛋白對巨噬細胞活性的影響提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1人單核細胞 THP

5、-1經(jīng) PMA（15ng/ml）誘導(dǎo)分化為巨噬細胞，命名為 mTHP-1細胞。以不同濃度 HCV核心蛋白（1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）分別作用不同來源巨噬細胞 mTHP-1和 RAW264.70.5h，Western blot檢測胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB Phospho-P65和 Phospho-ERK變化情況。同時以 PBS組做為陰性對照組，LPS（1μg/ml）組作為陽性對照組。并確定HCV核心蛋白作用

6、的最適濃度為5μg/ml。
　　2 HCV核心蛋白（5μg/ml）和LPS以不同分組方式分別作用mTHP-1、RAW264.7和 BMDM細胞6h，收集細胞；采用 qRT-PCR檢測細胞因子 IFN-γ mRNA的表達變化，流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測 RAW264.7細胞表達IFN-γ蛋白的變化。同時設(shè)PBS作用組和LPS作用組分別做為陰性和陽性對照組，HCV核心蛋白作用組及HCV核心蛋白+LPS共同作用組為實驗組。
　　3應(yīng)

7、用 NF-κB通路阻斷劑 JSH-23（10μM）預(yù)處理 RAW264.7細胞1h后，加入LPS（1μg/ml）再次作用細胞6h，收集細胞，采用qRT-PCR和流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測IFN-γmRNA和蛋白的表達變化。
　　4 HCV核心蛋白（5μg/ml）和 LPS（1μg/ml）以不同分組方式分別作用mTHP-1、RAW264.7和BMDM細胞0.5h后，Western blot檢測不同細胞的信號通路分子 p-P65、p-P

8、105、p-ERK、p-JNK和 p-P38的表達變化。實驗組及對照組同2。
　　5不同濃度的 HCV核心蛋白（1μg/ml、3μg/ml和5μg/ml）和 LPS（1μg/ml）共同作用RAW264.7細胞0.5h后，Western blot檢測細胞信號通路分子 p-P65、p-P105和 p-ERK的變化情況。設(shè) PBS組和 LPS組為對照組。
　　6以 ERK通路阻斷劑 PD98059（10μM、25μM和50μM）預(yù)

9、處理RAW264.7細胞1h后，加入 LPS（1μg/ml）作用0.5h后，Western blot檢測p-ERK表達變化，確定抑制劑使用的最佳濃度為50μM。
　　7應(yīng)用 ERK阻斷劑 PD98059預(yù)處理 RAW264.7細胞1h后，加入LPS（1μg/ml）和HCV（5μg/ml）核心蛋白繼續(xù)作用0.5h或者6h后分別收集細胞，采用Western blot和qRT-PCR檢測胞內(nèi)信號通路分子NF-κB p-P65、p-P10

10、5和IFN-γ mRNA的表達變化。同時設(shè)PBS組和LPS組為對照組。
　　8分別應(yīng)用 JNK阻斷劑 SP600125和 P38阻斷劑 SB203580預(yù)處理RAW264.7細胞1h后，加入 LPS（1μg/ml）和 HCV核心蛋白（5μg/m l）繼續(xù)作用6h后分別收集細胞，采用qRT-PCR檢測IFN-γ mRNA的表達變化。同時設(shè)PBS組和LPS組為對照組。
　　結(jié)果：
　　1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細

11、胞產(chǎn)生IFN-γ
　　qRT-PCR檢測 mTHP-1、RAW264.7及 BMDM三種細胞表達 IFN-γmRNA的水平，與LPS組相比，HCV核心蛋白+LPS共同作用組細胞表達IFN-γmRNA水平均顯著降低（P<0.05）。
　　同時采用流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測 RAW264.7細胞在不同刺激劑作用下IFN-γ蛋白的表達變化，與qRT-PCR結(jié)果一致。
　　2 LPS通過活化NF-κB通路誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生IFN-

12、γ
　　應(yīng)用 NF-κB通路阻斷劑 JSH-23預(yù)處理 RAW264.7細胞后，與未加阻斷劑的陽性對照組相比，LPS作用巨噬細胞 IFN-γ mRNA表達顯著降低（P<0.05）。
　　流式細胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測的結(jié)果與熒光定量 PCR結(jié)果一致，與未加阻斷劑的陽性對照組相比，JSH-23預(yù)處理細胞后LPS組IFN-γ陽性細胞數(shù)明顯減少。
　　3 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞P65和P105的磷酸化
　　We

13、stern blot結(jié)果顯示， LPS和 HCV核心蛋白作用 mTHP-1、RAW264.7及BMDM細胞后，與PBS組比較，LPS組NF-κB p-P65和p-P105升高；與 LPS組相比，在 HCV核心蛋白+LPS組中，NF-κB p-P65和p-P105表達降低。
　　應(yīng)用不同濃度 HCV核心蛋白與 LPS共同作用 RAW264.7細胞， Western blot結(jié)果顯示，隨著HCV核心蛋白濃度升高，細胞內(nèi)的NF-κB p

14、-P65和 p-P105的表達水平減少，提示 HCV核心蛋白抑制被 LPS誘導(dǎo)的NF-κB p-P65和p-P105的表達具有濃度依賴性。
　　4 HCV核心蛋白和LPS均可誘導(dǎo)巨噬細胞P65和ERK的磷酸化
　　以不同濃度 HCV核心蛋白刺激 mTHP-1和 RAW264.7細胞，使用Western blot方法檢測胞內(nèi)p-P65和p-ERK表達變化，與PBS組比較，LPS組細胞p-P65和p-ERK明顯升高；雖然HCV核

15、心蛋白也可引起p-P65和p-ERK升高，但是活化程度弱于單獨LPS刺激組。
　　5 HCV核心蛋白不能抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞ERK的磷酸化
　　Western blot結(jié)果顯示，與LPS組比較，LPS+HCV核心蛋白共同作用組細胞p-ERK的表達水平無明顯降低。
　　應(yīng)用不同濃度 HCV核心蛋白與 LPS共同作用 RAW264.7細胞， Western blot結(jié)果顯示，隨著HCV核心蛋白濃度升高，細胞的p-ERK的

16、表達水平無明顯降低。
　　6 HCV核心蛋白通過活化ERK通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞NF-κB通路的活化和IFN-γmRNA表達的升高
　　應(yīng)用 PD98059阻斷 ERK通路后，與 LPS組比較，HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)NF-κB p-P65和p-P105表達無明顯差異，并且兩組間IFN-γmRNA的表達也無明顯差異。
　　7 HCV核心蛋白不能通過JNK或P38通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞IFN-γ mR

17、NA表達的升高
　　Western blot結(jié)果顯示，與LPS組比較，LPS+HCV核心蛋白共同作用組細胞p-JNK和p-P38的表達水平無明顯降低。
　　分別應(yīng)用JNK阻斷劑SP600125和P38阻斷劑SB203580阻斷JNK和 P38通路后，與 LPS組比較，HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)IFN-γmRNA的表達仍顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)