LIPUS對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系U937炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)U937細(xì)胞，構(gòu)建炎癥模型。應(yīng)用低強度脈沖超聲（Low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）處理，探討LIPUS是否對炎癥存在抑制作用，并探討其主要作用機制。
　　方法：
　　1.體外應(yīng)用佛波酯（Phorbol12-myristate13-acetate，PMA）誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞成熟。篩選LPS濃度

2、。分組：U937細(xì)胞；不同濃度的LPS（0.05-10μg/ml）誘導(dǎo)U937細(xì)胞組。24h后收集上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測炎癥因子腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α，TNF-α）的含量。篩選LIPUS強度。分組：U937細(xì)胞組； LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞組；不同參數(shù)LIPUS（10，30，60，90mW/cm2）刺激L

3、PS介導(dǎo)下的U937細(xì)胞組。收集上清液及細(xì)胞團(tuán)塊，采用ELISA檢測各組TNF-α及白介素-8（Interleukin-8，IL-8）的表達(dá)情況，實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測（Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）各組中IL-8的基因變化情況。
　　2.U937細(xì)胞增殖活力檢測。采用96孔板構(gòu)建模型，分組：單獨U937細(xì)胞組；LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞組；LIPUS刺激LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞組

4、；LIPUS刺激U937細(xì)胞組；Bay11-7082刺激LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞組。應(yīng)用細(xì)胞技術(shù)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8）檢測U937細(xì)胞增殖活力。洗去CCK-8檢測液，換成普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于第3,5,7天再次檢測。U937細(xì)胞凋亡檢測。采用10cm培養(yǎng)皿構(gòu)建模型，分組同上，處理后胰酶消化，流式細(xì)胞檢測儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　3.探討LIPUS刺激對LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。分

5、組：U937細(xì)胞組；LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞組；LIPUS刺激LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞組；LIPUS刺激U937細(xì)胞組。ELISA及RT-PCR檢測炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8）表達(dá)情況。
　　4.探討LIPUS刺激對LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機制。分組：U937細(xì)胞組；LPS誘導(dǎo)U937細(xì)胞組；LIPUS刺激LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞組；Bay11-7082刺激LPS介導(dǎo)的U937細(xì)胞組。RT-PCR

6、檢測炎癥因子及TLR4基因表達(dá)；聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（Western blot，WB）檢測TLR4、p65、p-IκBα和IκBα蛋白含量；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察p65入核情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功獲得成熟U937細(xì)胞并構(gòu)建炎癥模型，篩選LPS濃度為1μg/ml、LIPUS強度為60mW/cm2。
　　2.CCK-8檢測及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，LPS明顯抑制U937細(xì)胞增殖、促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡，而LIPUS對

7、此反應(yīng)有一定抑制作用。
　　3.ELISA和RT-PCR檢測結(jié)果顯示：LPS促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，而LIPUS起明顯的抑制作用。
　　4.RT-PCR檢測示：LIPUS抑制炎癥因子以及TLR4的表達(dá)；WB檢測結(jié)果示：LPS加速了IκBα的磷酸化、p65的跨膜轉(zhuǎn)位入核以及TLR4的蛋白表達(dá)，而LIPUS阻斷了IκBα的磷酸化和p65入核的過程，但對TLR4蛋白表達(dá)的抑制作用不明顯；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察可見：LPS促進(jìn)p65入