Ghrelin對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：Ghrelin對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1和G1表達(dá)的調(diào)控作用
　　 背景：ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1和G1是兩種胞膜蛋白。在動脈壁，ABCA1是單核巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的重要途徑，其基因突變可引起胞內(nèi)膽固醇流出障礙；ABCG1也是單核巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的途徑之一，有助于清除脂質(zhì)，防止泡沫細(xì)胞形成，從而抑制動脈粥樣硬化的形成。Ghrelin是一種促生長激素釋放肽，與糖脂代

2、謝及相關(guān)疾病有密切聯(lián)系，諸多研究提示Ghrelin在AS的發(fā)展中扮演著有益的角色，但Ghrelin對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的調(diào)控作用及機(jī)制尚未見報道。
　　 目的：本研究探討了Ghrelin對單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中胞內(nèi)脂滴含量的影響，同時研究單核/巨噬細(xì)胞分化成為泡沫細(xì)胞過程中Ghrelin對ABCA1和ABCG1表達(dá)的調(diào)控作用，以揭示其抗AS的效應(yīng)及其機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人源單核細(xì)胞系THP-1，由佛波酯

3、作用使其分化為巨噬細(xì)胞，后者可在在氧化低密度脂蛋白存在條件下進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，油紅O染色法鑒定泡沫細(xì)胞形成。巨噬細(xì)胞加入不同濃度的Ghrelin預(yù)孵2小時后再加入ox-LDL共同孵育不同時間，隨后各組均加入10mg/L的apoA-I，CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時。油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，運用PT-PCR法檢測ABCA1和ABCG1mRNA水平，Western-blot法檢測ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)，采用酶法，通過熒光分光

4、光度計檢測細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量并計算膽固醇流出率。
　　 結(jié)果：Ghrelin可明顯減少細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成，顯著增加胞內(nèi)游離膽固醇流出率，隨著Ghrelin濃度增高，其抑制胞內(nèi)膽固醇酯含量和增加膽固醇流出率的作用增強(qiáng)，10-7 mol/L，10-6 mol/L和10-5 mol/L Ghrelin干預(yù)組膽固醇流出率分別為(29.3±1.1)%，(36.0±1.4)%和(41.6±2.1)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；膽固醇酯含量分別為34

5、.5±3.0、27.8±2.3、24.3±2.3，與泡沫細(xì)胞組相比有顯著差異。但不同作用時間組無明顯差別。Ghrelin能顯著增加單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中ABCA1和ABCG1 mRNA水平和蛋白表達(dá)，不同濃度干預(yù)組ABCA1/G1表達(dá)有顯著差異，不同時間組ABCA1/G1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：Ghrelin能上調(diào)ABCA1和ABCG1 mRNA與蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇流出，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成，并

6、可能因此而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生；Ghrelin的上述作用呈濃度依賴性而不呈時間依賴性。
　　 第二部分：Ghrelin 通過生長激素促分泌素受體抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成
　　 背景：Ghrelin是生長激素促分泌素受體的配體，能通過與該受體結(jié)合發(fā)揮促生長激素分泌的效應(yīng)。巨噬細(xì)胞膜上也同樣表達(dá)GHS-R，目前研究表明在動脈粥樣硬化斑塊處Ghrelin受體的密度明顯上調(diào)。
　　 目的：以人單核細(xì)胞系THP-1源

7、性泡沫細(xì)胞為研究對象，探討不同程度拮抗GHS-R受體后，Ghrelin對單核巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成過程中人ACAT-1和ABCA1/G1基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。檢測不同程度拮抗GHS-R受體后，Ghrelin對單核巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響，其胞內(nèi)膽固醇酯含量及膽固醇流出率變化。
　　 方法：體外培養(yǎng)THP-1，由佛波酯誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，繼而在氧化低密度脂蛋白存在條件下進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，油紅O染色法鑒定泡沫細(xì)胞形成

8、。單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，與不同濃度GHS-R特異性拮抗劑[D-Lys3]-GHRP-6 預(yù)孵2h后，再與Ghrelin共育，2h后加入ox-LDL作用24h。隨后各組均加入10mg/L的apoA-I，CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時。運用PT-PCR法和Western-blot法分別檢測Ghrelin干預(yù)后及拮抗生長激素促分泌素受體后ACAT-1、ABCA1和ABCG1 mRNA水平與ACAT-1蛋白表達(dá)，采用酶法，通過熒光分光光度計檢測

9、細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量和游離膽固醇含量，并計算膽固醇酯含量和膽固醇流出率。
　　 結(jié)果：油紅O染色結(jié)果顯示GHS-R 拮抗劑[D-Lys3]-GHRP-6 阻斷Ghrelin對巨噬細(xì)胞泡沫化的抑制作用。Ghrelin能顯著降低單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中ACAT-1mRNA水平和蛋白表達(dá)，不同濃度[D-Lys3]-GHRP-6干預(yù)后，ACAT-1 mRNA水平逐漸增高，分別為1.14±0.04，1.58±0.03和2.4±0.16，A

10、CAT-1蛋白表達(dá)也逐漸增高，分別為1.25±0.09，1.77±0.11和2.3±0.09，與Ghrelin組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，Ghrelin 能顯著增加單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中ABCA1/G1 mRNA水平和蛋白表達(dá)。拮抗GHS-R后，Ghrelin抑制泡沫細(xì)胞形成的效應(yīng)被阻斷，且GHS-R特異性拮抗劑濃度越高，該阻斷作用越明顯。膽固醇含量檢測結(jié)果表明，不同濃度[D-Lys3]-GHRP-6干預(yù)組較Ghrelin組胞

11、內(nèi)膽固醇酯含量分別升高了(16.7±1.2)%，(54.5±4.5)%和(73.4±7.9)%，阻斷了Ghrelin抑制膽固醇酯形成的作用作用。膽固醇流出率結(jié)果則表明，[D-Lys3]-GHRP-6 也阻斷了Ghrelin對膽固醇流出的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：Ghrelin可能通過GHS-R途徑下調(diào)ACAT-1轉(zhuǎn)錄翻譯水平，及上調(diào)ABCA1/G1轉(zhuǎn)錄翻譯水平，從而抑制膽固醇聚集于巨噬細(xì)胞，并同時促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇的流出，避免游離膽固

12、醇滯留于細(xì)胞。若拮抗Ghrelin的受體GHS-R，則Ghrelin的這種有益的效應(yīng)被阻斷，而不能發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的作用。
　　 第三部分：過氧化物酶體增生物激活受體γ信號通路參與Ghrelin抑制巨噬細(xì)胞泡沫化過程
　　 背景：過氧化物酶體增生物激活受體γ是PPAR 超家族的亞型之一，屬于核受體轉(zhuǎn)錄蛋白。PPARγ表達(dá)于巨噬細(xì)胞核內(nèi)，并被證實能調(diào)節(jié)細(xì)胞和動脈壁脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，提示其在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮著重要作用。

13、r>　　 目的：以人單核/巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞為研究對象，探討Ghrelin對人單核細(xì)胞系源性泡沫細(xì)胞PPARγ表達(dá)的調(diào)控作用；探討不同程度地抑制PPARγ后，胞內(nèi)膽固醇酯含量及膽固醇流出率的變化；探討不同程度抑制PPARγ對Ghrelin調(diào)控ACAT-1、ABCA1和ABCG1 mRNA與蛋白表達(dá)的影響，從而確定PPARγ信號通路是否為Ghrelin抑制巨噬細(xì)胞泡沫化的機(jī)制之一。
　　 方法：體外培養(yǎng)THP-1，在佛波酯的誘

14、導(dǎo)下分化為巨噬細(xì)胞，與不同濃度ghrelin 預(yù)孵后加入氧化低密度脂蛋白共育24h。運用PT-PCR法和Western-blot法分別檢測不同濃度Ghrelin作用后PPARγmRNA與蛋白的表達(dá)。巨噬細(xì)胞與不同劑量PPARγ特異性抑制劑GW9662 預(yù)孵2h后，加入Ghrelin作用2h，再與終濃度為100mg/L ox-LDL共育24h，隨后各組均加入10mg/L的apoA-I，CO2培養(yǎng)箱中孵育12小時。油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴

15、含量；PT-PCR法和Western-blot法分別檢測Ghrelin干預(yù)后PPARγmRNA與蛋白的表達(dá)，以及不同程度抑制PPARγ后ACAT-1、ABCA1和ABCG1mRNA 水平與ACAT-1蛋白表達(dá)，采用酶-熒光分光光度計法檢測細(xì)胞內(nèi)外膽固醇含量和游離膽固醇含量，并計算膽固醇流出率。
　　 結(jié)果：與泡沫細(xì)胞組相比，不同濃度組Ghrelin能顯著增加單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中PPARγmRNA與蛋白表達(dá)，且干預(yù)的Ghre

16、lin濃度越高，PPARγ表達(dá)越高，其mRNA表達(dá)分別為0.87±0.06，1.44±0.15，1.57±0.11，其蛋白表達(dá)分別為0.82±0.06，1.46±0.11，1.73±0.14，與泡沫細(xì)胞組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。抑制PPARγ后，Ghrelin抑制泡沫細(xì)胞形成的效應(yīng)被阻斷，且PPARγ抑制劑濃度越高，該阻斷作用越明顯。PPARγ的抑制劑GW9662還拮抗了Ghrelin對巨噬細(xì)胞泡沫化過程中ACAT-1和ABCA1/

17、G1 mRNA水平和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，隨著PPARγ抑制劑劑量的增高，其阻斷Ghrelin下調(diào)ACAT-1和上調(diào)ABCA1/G1的效應(yīng)越顯著。膽固醇流出率結(jié)果顯示，GW9662對照組和泡沫細(xì)胞組胞內(nèi)膽固醇酯含量及膽固醇流出率無顯著差別；不同劑量GW9662干預(yù)后，胞內(nèi)膽固醇含量較Ghrelin組升高了(18.3±4.3)%，(30.6±11.4)%，(52.6±8.4)%；而膽固醇流出率則分別下降了(14.3±3.2)%，(27.3±