苦參堿對(duì)U937細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用研究.pdf

1、研究背景及目的：淋巴瘤是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤，U937細(xì)胞是目前大量應(yīng)用于基礎(chǔ)研究的淋巴瘤細(xì)胞株。淋巴瘤的治療仍以化療為主，主要藥物包括阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和放線菌D等，因選擇性較差，毒副作用較大，對(duì)正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有較大的損害，長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用受到限制。所以，尋找選擇性高和毒副作用小的藥物是目前提高臨床療效的重要途徑?？鄥A(Matrine，Mat，C<,15> H<,24>N<,20>)是豆科槐屬植物苦參或平科植物廣豆根中分

2、離出來(lái)的一種生物堿，盛產(chǎn)于我國(guó)西部地區(qū)。近年來(lái)，Mat體內(nèi)外抗腫瘤活性受到極大關(guān)注，有研究報(bào)道Mat對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡作用，但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)Mat對(duì)U937細(xì)胞作用的相關(guān)研究。 本實(shí)驗(yàn)擬①觀察Mat對(duì)體外培養(yǎng)的人組織淋巴瘤細(xì)胞U937及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的形態(tài)學(xué)變化、乳酸脫氫酶活性改變、細(xì)胞周期影響，探討Mat是否對(duì)L1937

3、細(xì)胞具有增殖抑制增殖抑制效應(yīng)；②觀察Mat對(duì)HUVECs的毒副作用；③觀察Mat作用U937細(xì)胞后形態(tài)學(xué)改變、凋亡率及Bcl-2mRNA的表達(dá)變化，探討Mat對(duì)U937細(xì)胞凋亡作用的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。 方法： 1．采用倒置顯微鏡、臺(tái)盼藍(lán)拒染法、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶活性測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，研究Mat體外對(duì)U937細(xì)胞和HUVECs增殖影響及其與細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)系。

4、 2．觀察經(jīng)Mat誘導(dǎo)后U937細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(包括核漿成熟情況、核漿比例、細(xì)胞直徑、細(xì)胞體積、細(xì)胞器及特殊物質(zhì)形成等)。 3．Annexin V-FITC雙染法顯示經(jīng)Mat誘導(dǎo)后U937細(xì)胞凋亡率。 4．瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)經(jīng)Mat誘導(dǎo)后U937細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征。 5．RT-PCR檢測(cè)經(jīng)Mat誘導(dǎo)后U937細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/

5、ml)作用1d、2d、3d、4d、5d后對(duì)U937細(xì)胞均有增殖抑制作用，在該濃度范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴性，其半數(shù)抑制濃度為0.4mg/ml，有效作用時(shí)間為1d；Mat(0.1 mg/ml～1.0mg/ml)作用1d、2d、3d、4d、5d后對(duì)腫VECs無(wú)明顯增殖抑制作用，亦無(wú)劑量和時(shí)間依賴性； 2．Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/ml)作用U937細(xì)胞48h后，S期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞發(fā)生S期阻滯；對(duì)HUVECs細(xì)胞周期無(wú)

6、明顯影響； 3．0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml Mat均可使U937細(xì)胞核漿比例下降，染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)凋亡小體，隨Mat濃度增加細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?cè)矫黠@。 4．AnnexinV-FITC雙染法顯示Mat(0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml)作用U937細(xì)胞72h后細(xì)胞凋亡率分別為3.25％、5.32％、8.17％、

7、11.20％、16.05％、22.25％、28.58％，與U937細(xì)胞對(duì)照組(1.84％)及Mat 0.1mg/ml組(1.95％)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；瓊脂糖凝膠電泳法(agarose gel electrophoresis，AGE)顯示0.3～1.0mg/ml Mat作用U937細(xì)胞72h后凋亡細(xì)胞可形成明顯的DNA梯度。 5．RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示U937細(xì)胞經(jīng)Mat(0.2 mg/ml～1.0mg/ml)作用72h后B

8、cl-2 mRNA表達(dá)明顯減弱，隨劑量增加表達(dá)減弱越明顯。 結(jié)論： 1．Mat在一定濃度和時(shí)間對(duì)U937細(xì)胞具有增殖抑制作用，呈量-效和時(shí)-效依賴關(guān)系； 2．Mat對(duì)U937細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，呈量-效和時(shí)-效依賴關(guān)系； 3．Mat能影響U937細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，下調(diào)c-myc的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 4．Mat在一定濃度和時(shí)間不能抑制HUVECs增殖，對(duì)其細(xì)胞周期亦無(wú)明顯影響