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文檔簡介
1、目的:從傳統(tǒng)的中草藥中尋找新的抗癌藥物,運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對其藥理學(xué)作用進(jìn)行新的探索和詮釋,已成為當(dāng)前中草藥研究的趨勢??鄥A是從我國傳統(tǒng)中藥苦參中提取出的一種生物堿活性成分,具有廣泛的藥理學(xué)作用。我們多年來的研究證明,苦參堿在體外可明顯抑制人白血病細(xì)胞K562的增殖,誘導(dǎo)其向正常形態(tài)分化并顯著影響細(xì)胞周期和端粒酶活性。這些表型的改變是基因差異表達(dá)的結(jié)果。運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片,我們發(fā)現(xiàn)了多個相關(guān)的差異表達(dá)基因,包括功能已知的和功能未明
2、的。 CGI-100是功能未明的基因之一,本課題旨在了解CGI-100基因與苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化和凋亡的關(guān)系,為研究腫瘤發(fā)生和逆轉(zhuǎn)開辟新的途徑;為尋找腫瘤治療新靶點、探索苦參堿抗腫瘤作用、開發(fā)腫瘤治療新藥物提供實驗基礎(chǔ)。 方法: 1.利用RT-PCR半定量檢測苦參堿作用K562細(xì)胞前后CGI-100基因的表達(dá)情況。 2.從K562細(xì)胞中提取總RNA,RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到CGI-100基因CDS片
3、斷,A-T克隆至pMD18-T載體,經(jīng)測序鑒定后定向亞克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中,構(gòu)建得到pIRES2-EGFP/CGI-100重組質(zhì)粒。 3.將plRES2-EGFP/CGI-100重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,G418穩(wěn)定篩選4w后,有限稀釋法篩選得到單個克隆K562陽性細(xì)胞株,將其命名為K562-CGI-100細(xì)胞,以此重組的K562細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。 4.以K562-CGI-100細(xì)胞為實驗對象,RT
4、-PCR檢測目的基因的表達(dá)狀況,電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果: 1.0.1~1.0mg/ml苦參堿處理K562細(xì)胞后,CGI-100基因表達(dá)呈劑量依賴性下降;0.1mg/ml苦參堿處理K562細(xì)胞3h內(nèi)CGI-100mRNA表達(dá)迅速降低,與對照有顯著性差異(p<0.05),3h~48h內(nèi)保持相同的低表達(dá)水平。 2.成功構(gòu)建帶有EGFP篩選標(biāo)記的CGI-100基因真核表達(dá)載體pIRE
5、S2-EGFP/CGI-100,經(jīng)雙酶切和質(zhì)粒測序鑒定,該重組質(zhì)粒序列正確,基因插入方向正確。 3.將上述構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞,經(jīng)G418抗性篩選和有限稀釋篩選出單個陽性細(xì)胞克隆,熒光倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá);RT-PCR鑒定有CGI-100 mRNA的過量表達(dá)。該重組K562細(xì)胞陽性單個克隆在體外穩(wěn)定傳代擴(kuò)增后作為后續(xù)的實驗對象。 4.K562細(xì)胞中CGI-100基因的過表達(dá)后,細(xì)胞常染
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