新基因CGI-100在苦參堿誘導K562細胞分化和凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：從傳統(tǒng)的中草藥中尋找新的抗癌藥物，運用現(xiàn)代分子生物學手段對其藥理學作用進行新的探索和詮釋，已成為當前中草藥研究的趨勢?？鄥A是從我國傳統(tǒng)中藥苦參中提取出的一種生物堿活性成分，具有廣泛的藥理學作用。我們多年來的研究證明，苦參堿在體外可明顯抑制人白血病細胞K562的增殖，誘導其向正常形態(tài)分化并顯著影響細胞周期和端粒酶活性。這些表型的改變是基因差異表達的結(jié)果。運用基因表達譜芯片，我們發(fā)現(xiàn)了多個相關的差異表達基因，包括功能已知的和功能未明

2、的。 CGI-100是功能未明的基因之一，本課題旨在了解CGI-100基因與苦參堿誘導K562細胞分化和凋亡的關系，為研究腫瘤發(fā)生和逆轉(zhuǎn)開辟新的途徑；為尋找腫瘤治療新靶點、探索苦參堿抗腫瘤作用、開發(fā)腫瘤治療新藥物提供實驗基礎。 方法： 1．利用RT-PCR半定量檢測苦參堿作用K562細胞前后CGI-100基因的表達情況。 2．從K562細胞中提取總RNA，RT-PCR反應擴增得到CGI-100基因CDS片

3、斷，A-T克隆至pMD18-T載體，經(jīng)測序鑒定后定向亞克隆至真核表達載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建得到pIRES2-EGFP/CGI-100重組質(zhì)粒。 3．將plRES2-EGFP/CGI-100重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細胞，G418穩(wěn)定篩選4w后，有限稀釋法篩選得到單個克隆K562陽性細胞株，將其命名為K562-CGI-100細胞，以此重組的K562細胞進行后續(xù)實驗。 4．以K562-CGI-100細胞為實驗對象，RT

4、-PCR檢測目的基因的表達狀況，電鏡觀察細胞形態(tài)學改變，流式細胞術檢測細胞周期的變化。 結(jié)果： 1．0.1～1.0mg/ml苦參堿處理K562細胞后，CGI-100基因表達呈劑量依賴性下降；0.1mg/ml苦參堿處理K562細胞3h內(nèi)CGI-100mRNA表達迅速降低，與對照有顯著性差異(p<0.05)，3h～48h內(nèi)保持相同的低表達水平。 2．成功構(gòu)建帶有EGFP篩選標記的CGI-100基因真核表達載體pIRE

5、S2-EGFP/CGI-100，經(jīng)雙酶切和質(zhì)粒測序鑒定，該重組質(zhì)粒序列正確，基因插入方向正確。 3．將上述構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細胞，經(jīng)G418抗性篩選和有限稀釋篩選出單個陽性細胞克隆，熒光倒置顯微鏡下觀察到細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達；RT-PCR鑒定有CGI-100 mRNA的過量表達。該重組K562細胞陽性單個克隆在體外穩(wěn)定傳代擴增后作為后續(xù)的實驗對象。 4．K562細胞中CGI-100基因的過表達后，細胞常染