DBO誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與自噬的作用研究.pdf

1、背景：慢性髓系細(xì)胞白血病(CML)是一種起源于多能干細(xì)胞的髓系惡性增殖性腫瘤，t(9;22)(q34; q11)是CML特征性染色體改變并在分子水平上導(dǎo)致BCR-ABL融合基因形成的。這種BCR-ABL融合基因形成的融合蛋白是一種能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的多種信號(hào)蛋白相關(guān)的酪氨酸激酶。目前酪氨酸激酶抑制劑(TKI)（包括伊馬替尼，格列衛(wèi)等）已廣泛用于CML治療，使大部分CML忠者生存期延長(zhǎng)，達(dá)到細(xì)胞遺傳學(xué)或分子生物學(xué)上的緩解。隨著TKI臨床應(yīng)用時(shí)

2、間延長(zhǎng)，TKI耐藥的問(wèn)題也越來(lái)越明顯，積極探索新的藥物是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。
　　DBO（6，8-dichoro-2，3-dihydro-3-hydroxymethyl-1，4-benzoxazine）是一種苯并惡嗪衍生物，有研究證實(shí)其可作為哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞活性氧物質(zhì)(ROS)，從而誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，促進(jìn)其凋亡。然而，目前其抗腫瘤作用尚未廣泛研究，抗腫瘤作用的機(jī)制目前

3、尚無(wú)定論。關(guān)于DBO是否引起白血病細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡的研究尚未報(bào)道。本研究以人K562細(xì)胞為研究對(duì)象，分析DBO對(duì)K562細(xì)胞的增殖及其在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬方面的影響。
　　目的：本研究旨在探討DBO對(duì)人慢性髓系白血病K562細(xì)胞的增殖、自噬與凋亡的影響。
　　方法：常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)K562細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組(DMSO)、DBO處理組。處理24、48和72h后收集細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)LC3斑點(diǎn)的表達(dá);透射電鏡觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象。CCK-8比色法檢測(cè)K562細(xì)胞的活性和增殖能力。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K562細(xì)胞分裂能力。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，K562細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素處理后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，p62蛋白表達(dá)水平降低;經(jīng)50μmol/L DBO處理24、48和72h后，LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平與雷帕霉素處理后結(jié)果相似，并呈時(shí)間依賴性。

5、K562細(xì)胞經(jīng)10、25和50μmol/LDBO處理后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，p62蛋白表達(dá)水平降低，呈劑量依賴性，而使用自噬抑制劑3-MA后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)降低，P62蛋白表達(dá)升高。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，DBO作用72h后，與對(duì)照組相比，DBO處理組LC3斑點(diǎn)的表達(dá)量增加。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DBO處理組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多自噬小體和自噬溶酶體，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)邊緣化。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，DBO對(duì)K562細(xì)

6、胞的增殖具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴性。DBO經(jīng)不同濃度(10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)處理24 h的細(xì)胞增殖抑制率分別為（0.68±0.05）％、（2.76±0.35）％、（12.64±3.90）％、（22.58±2.41）％，F(xiàn)=67.389，P＜0.001，處理組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;48h的增殖抑制率分別為（3.83±1.06）％、（6.23±1.27）％、（15.

7、90±1.10）％、（24.50±2.51）％， F=145.738，P＜0.001，處理組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;72h的增殖抑制率分別為(8.78±1.28)％、（21.38±1.47）％、（32.11±2.01）％、(34.27±2.59)％，F(xiàn)=225.820，P＜0.001，處理組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示K562細(xì)胞經(jīng)DBO處理72h后，與對(duì)照組相比，G2/M期細(xì)胞比例增加，x2=276.706，