青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡及其VEGF的變化.pdf

1、目的：本實驗以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系的急變株K562細(xì)胞為研究對象，研究青蒿琥酯(artesunate，ART)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562凋亡作用及其VEGF的變化，為青蒿琥酯可能成為一種新的抗白血病藥物提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 方法：設(shè)空白對照組及各濃度ART(12.μg/ml、25μg/ml、50μg/,ml、100μg/ml)組作用K562細(xì)胞，繪制其生長曲線。同時用光鏡觀察K562細(xì)胞生長情況及不同濃度ART作用不同時間后

2、的細(xì)胞形態(tài)變化。為明確青蒿琥酯ART對K562細(xì)胞生長抑制的機(jī)理，采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測ART作用K562細(xì)胞后DNA含量變化分析細(xì)胞周期；用AnnexinVFITC染色后用FCM檢測K562細(xì)胞的早期凋亡；瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA片段化(DNAladder)，檢測K562細(xì)胞的晚期凋亡。同時用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測ART作用K562細(xì)胞前后細(xì)胞上清液中VEGF蛋白含量等方法研究青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中VE

3、GF表達(dá)的變化。 結(jié)果：從ART作用K562細(xì)胞后繪制的生長曲線看ART對K562細(xì)胞的生長有明顯的抑制，在光鏡下經(jīng)不同濃度ART作用不同時間后K562細(xì)胞受到不同程度的抑制在光鏡下可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)邊集、細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、核固縮、斷裂，可見凋亡小體(凋亡小體是染色質(zhì)片斷、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分，由細(xì)胞膜包裹而形成的圓形小體。凋亡小體可被周圍正常細(xì)胞識別和吞噬)。流式細(xì)胞儀(FCM)分析結(jié)果顯示：經(jīng)過ART作用后的K

4、562細(xì)胞有亞G1期細(xì)胞群出現(xiàn)，即出現(xiàn)凋亡峰，且凋亡細(xì)胞的百分率隨ART濃度增加而增加，說明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是ART抗白血病作用的重要機(jī)制之一。細(xì)胞周期分析顯示：經(jīng)ART作用后，S期細(xì)胞明顯減少，而G1期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞明顯阻滯于G1期，由于這種細(xì)胞周期的阻滯抑制了細(xì)胞的生長，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。用ART(50μg/ml、100μg/ml)作用48h后K562細(xì)胞凝膠電泳，可見典型的DNA片斷化特征，出現(xiàn)明顯的梯狀條帶(DNALadder)。本

5、研究用ELISA夾心抗體法檢測VEGF結(jié)果顯示：在ART誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡時也下調(diào)其VEGF蛋白的表達(dá)，K562細(xì)胞凋亡率與其上清液中的VEGF濃度的相關(guān)分析表明：隨著各ART組作用濃度遞增，在一定時間(24h-72h)范圍和濃度(IC50值2-7倍)范圍內(nèi)K562細(xì)胞凋亡率升高，與此同時K562細(xì)胞VEGF表達(dá)下調(diào)，此變化差異非常有統(tǒng)計學(xué)意義?？赡蹵RT誘導(dǎo)K562凋亡、抑制K562細(xì)胞生長與其下調(diào)其VEGF蛋白的表達(dá)也有關(guān)系。