RAS基因在K562細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、本研究的基本目標為利用RNAi方法研究N-RAS基因在凋亡信號傳導通路中的作用。實驗研究分為三個部分：首先以從人類紅白血病細胞株K562細胞為模型，以正常人外周血白細胞為對照，研究K562細胞株中N-RAS基因的表達情況，為RNA干擾實驗的可行性提供實驗依據(jù)；在上述實驗基礎上，在K562細胞中進行N-RAS基因干擾實驗，并分別在mRNA及細胞水平觀察N-RAS基因表達缺失的細胞表型；在研究N-RAS基因功能的同時，進行RNA干擾實驗條件

2、優(yōu)化的探索，具體研究mRNA二級結構對RNA干擾效果的影響，為提高RNA干擾效果提供實驗依據(jù)。 本研究主要針對以下方面開展研究： 1.對N-RAS基因在K562細胞中的表達情況進行研究。針對N-RAS基因組保守區(qū)域設計PCR特異性引物。擴增特異性片段，純化PCR產(chǎn)物，連接T載體并轉化；提取重組質粒，雙向測序鑒定，利用美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供的BLAST分析軟件，與NCBI所提供N-RAS基因序列進行比對，

3、檢測突變位點；以正常人外周血白細胞為對照，看家基因GAPDH為內參照，用RT-PCR方法對N-RAS基因表達水平進行測定。 2.進行siRNA的篩選與干擾的初步研究。特異性siRNA可在不同程度抑制目的基因的表達，而靶基因mRNA二級結構可能是引起這種程度差異的原因之一，因此在進行RNAi實驗中，siRNA的設計應將二級結構的因素考慮在內。根據(jù)測定序列設計siRNA。預實驗確定產(chǎn)生抑制效應后，利用RNAstructure3.5軟

4、件對N-RAS基因mRNA二級結構進行分析，并分別針對其二級結構與非二級結構區(qū)，利用網(wǎng)絡在線工具設計共4對siRNA，分別轉染K562細胞，轉染48及72h后，分別采用RT-PCR、MTT及流式細胞檢測等方法在mRNA及細胞水平檢測干擾效果差異。對不同時間和不同靶序列的干擾效果進行橫向及縱向比較，以探討時間及靶序列對干擾效果的影響。 上述研究的實驗結果表明，K562細胞中N-RAS基因無突變，其表達水平較正常細胞高。因而可推斷，

5、在K562細胞中進行N-RAS基因的RNAi實驗可行性高，實驗結果易于檢測。siRNA導入后，可引起mRNA表達水平的降低以及細胞不同程度的凋亡。誘導凋亡的效果在72h的干擾效果大于48h，針對非二級結構區(qū)靶序列的siRNA干擾效果優(yōu)于針對二級結構區(qū)的siRNA。抑制N-RAS基因在腫瘤細胞中的表達可誘導腫瘤細胞的凋亡，證實N-RAS基因在腫瘤細胞信號轉導中起到重要作用。 綜上所述，本研究對白血病細胞株K562細胞中的N-RAS