IGFBP7基因在K562細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)用作用機(jī)制的探討.pdf

1、第一部分，IGFBP7基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞的表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建IGFBP7（insulin-like growth factor binding protein 7）基因的慢病毒載體，為研究該基因在白血病中的功能提供基礎(chǔ)。
　　 方法：采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切獲得目的基因，基因重組構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒venus-/GFBP7，用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒感染K562細(xì)胞，并采用多種方法鑒定。
　　

2、 結(jié)果：所獲IGFBP7基因經(jīng)測(cè)序與GenBank比對(duì)序列一致。慢病毒載體質(zhì)粒venus-/GFBP7經(jīng)BamH1酶切鑒定片段大小正確。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)到GFP在293T及K562細(xì)胞中表達(dá)，RT-PCR和Western blot檢測(cè)到IGFBP7在K562細(xì)胞表達(dá)。
　　 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建帶有IGFBP7基因的慢病毒載體，為研究IGFBP7基因在K562細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分，IGFBP

3、7基因在K562細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究
　　 目的：通過(guò)成功構(gòu)建IGFBP7-K562細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，觀(guān)察IGFBP7基因?qū)Π籽〖?xì)胞株K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、穿膜等生物學(xué)行為的影響，初步探討IGFBP7基因在AML中的生物學(xué)功能。
　　 方法：通過(guò)CCK-8法及細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)觀(guān)察IGFBP7對(duì)細(xì)胞增殖的影響。利用ELISA方法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株培養(yǎng)上清中IGBP7的表達(dá)及觀(guān)察上述細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞增殖的影響

4、。通過(guò)流式分析細(xì)胞周期的變化及利用RT-PCR方法和Western Blot方法檢測(cè)cyclinD1的表達(dá)。通過(guò)穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGFBP7基因?qū)562細(xì)胞穿膜能力的影響。
　　 結(jié)果：通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在第二天IGFBP7轉(zhuǎn)染株相對(duì)于空載體載體轉(zhuǎn)染組明顯升高（升高23％），集落形成數(shù)量及大小IGFBP7轉(zhuǎn)染組也明顯高于空載體組(39±4vs26±6，P＜0.05)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IGFBP7轉(zhuǎn)染株組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IGFB

5、P7表達(dá)水平明顯高于空載體組及陰性對(duì)照組（76.37±2.19μg/Lvs63.52±2.29μg/Land60.31±0.24μg/L，P=0.0001），而且該培養(yǎng)上清具有促進(jìn)未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞增殖的能力（IGFBP7轉(zhuǎn)染株上清組VS空載體轉(zhuǎn)染株上清組：140%上升；d2;P＜0.05）。IGFBP7轉(zhuǎn)染株組細(xì)胞周期G0/G1期比例下降至35.34%±3.36%，而S期升至56.08%±1.85%，相對(duì)空載體轉(zhuǎn)染組具有明顯意義(P＜

6、0.05)，同時(shí)cyclinDlmRNA水平及蛋白水平在IGFBP7轉(zhuǎn)染組均是升高的。細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)表明IGFBP7轉(zhuǎn)染株組穿膜能力較對(duì)照組（空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組）明顯升高(18080±630vs4250±653vs5388±855;P＜0.05)。
　　 結(jié)論：IGFBP7基因具有促進(jìn)細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)展及穿膜能力，從而產(chǎn)生癌基因樣作用。
　　 第三部分，IGFBP7基因在K562細(xì)胞中分子機(jī)制探討
　　 目的

7、：為了進(jìn)一步明確IGFBP7在K562細(xì)胞中引起的一系列生物學(xué)功能變化的具體分子機(jī)制，我們通過(guò)基因芯片及western blot方法，從基因組與蛋白組水平來(lái)探索的該基因分子效應(yīng)作用機(jī)制。
　　 方法：通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出IGFBP7轉(zhuǎn)染株與空載體轉(zhuǎn)染株差異表達(dá)基因，利用定量PCR及western blot技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。定量PCR法檢測(cè)IGFBP7和AKT3基因在40例初診急性髓細(xì)胞白血病的表達(dá)情況，通過(guò)相關(guān)性分析兩基因間的相

8、關(guān)性。通過(guò)小分子抑制劑進(jìn)一步觀(guān)察細(xì)胞生物學(xué)特征的改變。
　　 結(jié)果：基因芯片篩選出10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，其中包括AKT3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芯片結(jié)果與定量PCR結(jié)果趨勢(shì)完全一致，證實(shí)了我們芯片結(jié)果的可靠性。同樣在IGFBP7轉(zhuǎn)染株組中AKT3總蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平亦升高。IGFBP7和AKT3基因在40例初診急性髓細(xì)胞白血病患者中表達(dá)量具有明顯相關(guān)性(r=0.505，P=0.001)。利用AKT抑制劑(tricirib