DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)作用.pdf

1、目的：
　　 1.研究DEPDC7基因在肝癌細(xì)胞中差異性表達(dá)及其蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 2.探討DEPDC7基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法：
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)正常肝細(xì)胞HL-7702、肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、Huh-7。
　　 2.用RT-PCR方法檢測(cè)DEPDC7基因mRNA在肝癌細(xì)胞的差異表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參，1.2％瓊脂糖凝膠電泳，用Gen

2、eTool 軟件進(jìn)行半定量分析。
　　 3.用Western Blot方法從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)肝癌細(xì)胞的DEPDC7蛋白的表達(dá)，用GeneTool軟件進(jìn)行半定量分析。
　　 4.構(gòu)建融合表達(dá)DEPDC7基因的pEGFP-C1-DEPDC7質(zhì)粒載體。轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞，然后用PI染色在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)DEPDC7蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　 5.用MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-D

3、EPDC7質(zhì)粒前后三株肝癌細(xì)胞的增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。
　　 6.轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞非融合表達(dá)DEPDC7基因的pIRES2-EGFP-DEPDC7質(zhì)粒，流式細(xì)胞儀和DNA ladder方法檢測(cè)DEPDC7基因表達(dá)上調(diào)后肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、凋亡。
　　 7.轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞pIRES2-EGFP-DEPDC7質(zhì)粒載體，通過(guò)細(xì)胞Transwell試驗(yàn)研究DEPDC7基因?qū)?xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　 8.RT-PCR

4、方法檢測(cè)DEPDC7基因?qū)η忠u相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR半定量分析，DEPDC7基因在腫瘤細(xì)胞的mRNA水平表達(dá)比正常肝細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，三株肝癌細(xì)胞兩兩之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。
　　 2.Western Blot 結(jié)果半定量分析，HL-7702與三株肝癌細(xì)胞在蛋白質(zhì)水平表達(dá)差異有顯著性（P<0.05）。三株肝癌細(xì)胞兩兩之間的表達(dá)水平比較也有顯著差異，Huh-7

5、中蛋白表達(dá)最低，有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。
　　 3.轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-DEPDC7質(zhì)粒載體的肝癌細(xì)胞DEPDC7蛋白主要定位于細(xì)胞膜上，胞質(zhì)內(nèi)也可見(jiàn)。
　　 4.生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖顯示，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)較快，在72h內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-DEPDC7質(zhì)粒后的肝癌細(xì)胞增殖較慢。
　　 5.上調(diào)DEPDC7基因的表達(dá)，細(xì)胞增殖率受抑制，但未見(jiàn)有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　 6.上調(diào)DEPDC7基因