RECK基因在胃癌中的表達及其對胃癌細胞生物學行為的影響的研究.pdf

1、第一部分:RECK基因在胃癌中的表達及臨床意義的實驗研究 目的:檢測基質金屬蛋白酶抑制基因RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs，RECK)及MMP-9在胃癌組織和正常胃組織中mRNA的表達水平并探討其臨床意義。 方法:采用逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR)，檢測47例胃癌患者的腫瘤組織和正常胃組織中RECK基因及MMP-9mRNA的表達。

2、 結果:47例胃癌患者的正常組織中RECKmRNA的相對表達量為0.793±0.012，腫瘤組織中的表達量為0.314±0.076，兩者差異有極顯著性意義(P＜0.01)；正常組織中MMP-9mRNA的相對表達量為0.225±0.107，腫瘤組織中的表達量為0.663±0.098，兩者表達有顯著性差異(P＜0.05)，胃癌組織中RECK基因mRNA的表達水平與MMP-9mRNA的表達水平呈正相關(r=0.55，P＜0.05)；R

3、ECK的表達水平與腫瘤浸潤深度和周圍臟器侵犯密切相關(P＜0.05)；RECK表達水平高于0.314的患者其2年生存率要顯著高于RECK表達水平低者(P=0.043)。 結論:胃癌組織中RECK基因的轉錄水平顯著降低，RECK基因與MMP-9存在某種共同的轉錄調節(jié)機制；RECK基因低表達的腫瘤具有更強的侵襲能力，其表達與胃癌患者的預后密切相關。RECK基因可能成為判斷胃癌患者預后的一種新指標及腫瘤治療的新靶點。 第二部分

4、:人RECK基因的分子克隆及真核表達載體的構建 目的:克隆人RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs)基因，并構建RECK基因的真核表達載體pcDNA3-RECK。 方法:從人的胎盤組織中提取總RNA，經逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出人RECK基因；將RECK基因克隆入載體pBluescriptⅡSK+中，陽性克隆經酶切、電泳鑒定

5、并測定RECK基因序列確認后將pBluescriptⅡSK+-RECK酶切所得RECK基因片段插入真核表達載體pcDNA3中，構建RECK基因的真核表達載體pcDNA3-RECK并經酶切鑒定。 結果:PCR擴增得到了特異性的4.4kb基因片段?；蚱蔚拇笮∨c預期一致。所獲得的RECK基因測序及BLAST分析證明克隆的人RECK基因序列正確，pcDNA3-RECK經酶切后得到5.4kb和4.4kb兩個片段。 結論:成功的

6、克隆了人RECK基因并正確構建了其真核表達載體pcDNA3-RECK。 第三部分:RECK基因對人胃癌細胞株MKN-45生物學行為的影響的研究 目的:探討轉染外源性的RECK基因對MKN-45胃癌細胞體外及體內生物學活性的影響。 方法:采用脂質體Lipofectamine2000介導將真核表達載體pcDNA3-RECK導入體外培養(yǎng)的MKN-45細胞，RT-PCR及Westernblot檢測轉染前后MKN-45細胞

7、中RECKmRNA和蛋白質的表達。明膠酶譜試驗檢測轉染前后細胞中MMP-9的活性。細胞計數法繪制各組細胞的生長曲線以觀察RECK基因對細胞增殖能力的影響；利用流式細胞儀方法檢測轉染前后細胞凋亡率；Boyden小室實驗計算各組穿膜的細胞數以比較轉染RECK基因對細胞侵襲能力的變化；比較裸鼠成瘤大小及腫瘤轉移的比例；應用免疫組織化學方法檢測裸鼠腫瘤組織中血管內皮細胞特異性第Ⅷ因子相關抗原(FⅧRAg)和各組細胞ICAM-1的表達，依據FⅧR

8、Ag的表達評價腫瘤組織內微血管密度(MVD)。 結果:轉染pcDNA3-RECK真核表達載體后MKN-45細胞能穩(wěn)定高表達RECKmRNA和蛋白，而轉染空質粒組和未轉染組未檢測到RECK基因的表達；轉染組中具有生物活性MMP-9的表達顯著降低(P＜0.05)。轉染前后MKN-45細胞的生長曲線、細胞體外遷徙能力以及細胞凋亡率無明顯差異(P＞0.05)，但其體外侵襲能力明顯下降(P＜0.05)；轉染RECK組細胞ICAM-1的表達

9、顯著減少(P＜0.05)。轉染RECK組的成瘤體積與轉染空質粒組無明顯差異(P＞0.05)，但轉染組遠處轉移率顯著低于未轉染組(P＜0.05)，轉染組腫瘤組織內MVD顯著降低(P＜0.01)。 結論:成功的利用脂質體Lipofectamine2000將真核表達載體pcDNA3-RECK導入倒MKN-45細胞，經過篩選后得到了穩(wěn)定高表達RECK蛋白的MKN-45細胞株，RECK基因能顯著抑制MMP-9的活性及ICAM-1的表達，R

10、ECK的表達不影響MKN-45細胞的生長、細胞體外遷徙能力、細胞凋亡率及成瘤體積，但可顯著抑制其體外和體內的侵襲及轉移能力以及抑制腫瘤血管的生成 第四部分:轉錄因子Sp1對人胃癌細胞MKN-45中RECK基因表達的調控作用 目的:探討腫瘤壞死因子a(TNF-α)對人胃癌細胞MKN-45中RECK基因及MMP-9表達的影響，檢測轉錄因子Sp1在調節(jié)RECK基因轉錄調控中的作用。 方法:將培養(yǎng)的MKN-45細胞分為3

11、組：A組1U/ml、5U/ml、10U/ml3種濃度的TNF-α作用人胃癌細胞MKN-45細胞株6h；B組用濃度為10U/ml的TNF-α作用MKN-45細胞1h、2h、4h、6h；C組用1mmol/ml、5mmol/ml、10mmol/ml的二硫代氨基甲酸吡硌烷(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)與TNF-α(10U/ml)同時作用于MKN-45細胞6h，RT-PCR法檢測三組細胞RECK基因mRNA的表

12、達，凝膠滯留電泳實驗(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)DNA結合反應檢測細胞Sp1的活性。 結果:未處理的MKN-45細胞不表達RECKmRNA，隨著TNF-α濃度的增加以及作用時間的延長，RECK基因出現表達且表達量顯著增加(P＜0.01)。TNF-α能激活Sp1的活性，PDTC能抑制TNF-α對Sp1的激活以及上調RECK基因轉錄的作用。 結論:TNF-α可通過激活Sp1