HoxC6對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一。我國胃癌發(fā)病率和死亡率仍高居世界第二位。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及微環(huán)境和基因改變，癌基因的活化是其重要機(jī)制。尋找新的癌基因并驗(yàn)證其對胃癌的作用，對確定生物學(xué)靶標(biāo)、干預(yù)癌變具有重要意義。
　　課題組前期通過胃癌組織基因芯片篩選可能與胃癌相關(guān)的候選基因，HoxC6是其中的一個候選促癌基因。HoxC6屬同源盒基因家族（簡稱:Hox家族）成員，含有兩個啟動子，轉(zhuǎn)錄兩條mRNA（HoxC6-1和HoxC6-2），其表

2、達(dá)產(chǎn)物是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)育控制起重要作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Hox家族基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。HoxC6與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系值得深入研究。
　　本研究將通過檢測胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表達(dá)水平，分析三者與患者臨床病理資料之間的相關(guān)性;通過siRNA干擾技術(shù)，特異性降低HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2表達(dá)，觀察其對胃癌細(xì)胞惡性生物

3、學(xué)行為（細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等）的影響，同時運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)篩選HoxC6潛在調(diào)控的基因、核酸并進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　內(nèi)容：
　　1、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在胃癌中的表達(dá)，及其與胃癌臨床資料之間的相關(guān)性
　?、賹?shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測比對47對胃癌組織與配對正常胃組織中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2mRNA表達(dá)水平;
　?、诮Y(jié)合胃癌患者臨床、病理資料，分析HoxC6、H

4、oxC6-1及HoxC6-2mRNA表達(dá)水平與各臨床、病理資料之間的相關(guān)性;
　?、踧RT-PCR和Western Blot檢測7株胃癌細(xì)胞及1株正常胃粘膜上皮細(xì)胞中HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表達(dá)情況。
　　2、特異性siRNA干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2后胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的變化
　?、俨捎眉?xì)胞活性實(shí)驗(yàn)(MTS)觀察siRNA干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2對SG

5、C-7901和BGC-823細(xì)胞增殖的影響;
　　②Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究siRNA干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2對SGC-7901和BGC-823細(xì)胞遷移、侵襲的影響;
　?、鄄捎昧魇郊?xì)胞儀檢測siRNA干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2后SGC-7901和BGC-823細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期變化。
　　3、HoxC6潛在調(diào)控基因、核酸的篩選及初步驗(yàn)證
　　運(yùn)用生物信息學(xué)

6、技術(shù)（TFSEARCH、TRANSFEC、MEME等軟件）預(yù)測HoxC6可能調(diào)控的基因或核酸，聯(lián)合genecards、pubmed、文獻(xiàn)等綜合得出基因、核酸的功能，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)中HoxC6在增殖、遷移、侵襲等方面的作用，篩選出HoxC6可能調(diào)控的有功能的基因、核酸，并分別在轉(zhuǎn)染HoxC6 siRNA的SGC-7901和BGC-823細(xì)胞中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2

7、在胃癌組織中表達(dá)量明顯增加，表達(dá)水平與胃癌患者腫瘤分期及淋巴結(jié)浸潤等呈不同程度相關(guān)
　　①胃癌組織中HoxC6、 HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA水平較正常胃組織顯著上調(diào)(p＜0.01);
　?、贖oxC6、HoxC6-1及HoxC6-2 mRNA水平與胃癌患者腫瘤分期及淋巴結(jié)浸潤等呈不同程度相關(guān);
　?、跦oxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在SGC-7901、BGC-823胃癌細(xì)胞株中表達(dá)量均相對較高（

8、用升高倍數(shù)folds±方差SD表示）。HoxC6:2.76±0.02、4.21±0.06;HoxC6-1:2.39±0.35、1.81±0.07; HoxC6-2:2.65±0.29、5.41±0.21。
　　2、siRNA干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2能不同程度抑制胃癌細(xì)胞增殖，siRNA干擾HoxC6-2能顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　①建立了分別成功干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的

9、胃癌細(xì)胞株系SGC-7901和BGC-823，通過qRT-PCR和Western Blot檢測進(jìn)行了驗(yàn)證;
　　②siRNA分別干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖(p＜0.01)（SGC-7901:抑制率IR依次為12.7％、9.76％、29.54％;BGC-823:IR依次為41.16％、38.08％、44.86％）;
　　③與空載組相比，干擾HoxC6-2能顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移（SG

10、C-7901:抑制率IR=65.62％、p＜0.01;BGC-823: IR=56.75％、p=0.04）和侵襲（SGC-7901:IR=55.72％、p=0.03;BGC-823: IR=46.07％、p＜0.01）;總凋亡較空載組顯著增加（ SGC-7901:5％±0.18％/7.94％±0.52％， p＜0.01; BGC-823:5.2％±0.47％/10.25％±0.58％，p＜0.01）、顯著影響細(xì)胞周期（SGC-7901:

11、G2期增加，p=0.02;BGC-823:G1期增加，p＜0.01）;而干擾HoxC6、HoxC6-1時，胃癌細(xì)胞的上述生物學(xué)行為受到影響，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。
　　3、HoxC6潛在調(diào)控基因、核酸的篩選及初步驗(yàn)證
　　①運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測到HoxC6可能調(diào)控的基因53個、micRNA和lncRNA共22個;
　　②篩選出重要的基因7個(JunD、BMP7、Bcl-2、 MKI67、 WIF1、CAS

12、P1、Spl);qRT-PCR證實(shí)siRNA干擾HoxC6后，JunD、BMP7、MKI67、CASP1、Sp1 mRNA水平顯著升高，而WIF1、Bcl-2 mRNA水平明顯下降。
　　③同時篩選到一個重要的長鏈非編碼RNA HOTAIR，發(fā)現(xiàn)HOTAIR在胃癌組織及多種胃癌細(xì)胞株中表達(dá)升高。siRNA干擾HoxC6后，HOTAIR的表達(dá)水平顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2在

13、人胃癌組織中表達(dá)量增加;
　　2、HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2的表達(dá)與胃癌患者腫瘤分期及淋巴結(jié)浸潤等呈不同程度相關(guān);
　　3、干擾HoxC6、HoxC6-1及HoxC6-2可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，尤以干擾HoxC6-2時抑制作用最明顯，且對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲有明顯抑制作用。研究結(jié)果提示HoxC6在胃癌的發(fā)生中可能扮演促癌基因的角色;
　　4、HoxC6可能通過與長鏈非編碼RNA HOTAIR互作，從而促