Gankyrin對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　Gankyrin是一個(gè)新的癌基因，最早在肝癌組織發(fā)現(xiàn)。Gankyrin編碼的蛋白含有226個(gè)氨基酸，由7個(gè)錨蛋白(ankyrin)重復(fù)序列組成，在結(jié)構(gòu)上高度保守，分子量約為25kDa。研究表明，肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中g(shù)ankyrin蛋白高表達(dá)，并且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，顯示gankyrin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。
　　盡管gankyrin在不少惡性腫瘤中高表達(dá)，然而現(xiàn)有的研究大部分集中

2、在gankyrin與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥等方面，在胃癌等其它腫瘤的研究還不夠深入，沒(méi)有形成體系，缺少gankyrin與胃癌、頭頸部腫瘤、肺癌、大腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤關(guān)系的研究。所以，本實(shí)驗(yàn)擬深入探討gankyrin對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性的影響及作用機(jī)制，對(duì)胃癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后判斷及尋找新的藥物靶點(diǎn)都具有重要意義。
　　方法:
　　1、采用Western blot法和免疫組織化學(xué)檢測(cè)胃癌和癌旁正常組織中g(shù)an

3、kyrin的表達(dá)，同時(shí)評(píng)價(jià)gankyrin與臨床特征的關(guān)系。
　　2、RT-PCR和Western blot檢測(cè)4種胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、HGC-27）中g(shù)ankyrin的蛋白及mRN表達(dá)水平。
　　3、使用脂質(zhì)體法將gankyrin的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入BGC-823細(xì)胞，將gankyrin特異siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胃癌HGC-27細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。
　

4、　4、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)等方法觀察gankyrin在胃癌細(xì)胞系增殖中的作用。
　　5、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)估gankyrin表達(dá)改變后，對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力及移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　6、Western blot及RT-PCR檢測(cè)gankyrin上調(diào)、下調(diào)表達(dá)后胃癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)分子(cyclinD1、cyclinE、PCNA、Rb、p53和p27)mRNA及蛋白表達(dá)的變化;Western b

5、lot檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況(PI3K、AKT、磷酸化PI3K和磷酸化AKT)。
　　7、MTT法檢測(cè)gankyrin與胃癌細(xì)胞化療藥物敏感性的關(guān)系，Hoechst及AV/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)凋亡蛋白caspase3和capase9的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、Gankyrin在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中存在不同程度的表達(dá)。Gankyrin在胃癌組織的陽(yáng)性表達(dá)

6、率100.00％(78/78)，明顯高于癌旁正常組織[癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率為62.82％(49/78)，P＜0.01]。各胃癌細(xì)胞系(SGC-7901、MGC-803、BGC-823和HGC-27)均有表達(dá)gankyrin，其中HGC-27表達(dá)水平最高，BGC-823最低。
　　2、Gankyrin對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)增殖能力的影響。轉(zhuǎn)染gankyrin正義表達(dá)載體的胃癌BGC-823細(xì)胞較親本細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著加快，進(jìn)入S期的

7、細(xì)胞比例增加，胃癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力及集落形成能力明顯增強(qiáng);而通過(guò)siRNA特異下調(diào)gankyrin表達(dá)的HGC-27胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力比親本細(xì)胞明顯減弱，處于S期的細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞集落形成能力顯著下降，裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)也明顯受到抑制。
　　3、Gankyrin調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)分子及對(duì)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白的影響。過(guò)表達(dá)gankyrin的BGC-823細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclinE、cyclin D1和PCN

8、A表達(dá)上調(diào)，而p27、p53和Rb表達(dá)下降。當(dāng)通過(guò)siRNA下調(diào)HGC-27細(xì)胞gankyrin表達(dá)后，cyclin E、cyclin D1和PCNA表達(dá)明顯下降，而p27、p53和Rb則表達(dá)升高。siRNA下調(diào)gankyrin的表達(dá)之后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達(dá)減少;而過(guò)表達(dá)gankyrin后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達(dá)增加。

9、r>　　4、Gankyrin與化療藥物敏感性的關(guān)系。siRNA下調(diào)HGC-27細(xì)胞gankyrin的表達(dá)與順鉑、5-Fu作用，細(xì)胞的IC50減少，凋亡細(xì)胞數(shù)增多，凋亡蛋白caspase3和caspase9表達(dá)增加;而轉(zhuǎn)染gankyrin正義載體的胃癌BGC-823細(xì)胞與順鉑、5-Fu作用，細(xì)胞的IC50升高，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，凋亡蛋白caspase3和caspase9表達(dá)下降。
　　結(jié)論:
　　1、胃癌組織gankyrin的表

10、達(dá)明顯高于癌旁正常組織，四種胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823和HGC-27）不同程度的表達(dá)gankyrin。
　　2、Gankyrin與胃癌細(xì)胞體內(nèi)、外的生長(zhǎng)增殖相關(guān)。
　　3、Gankyrin能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)分子來(lái)加速細(xì)胞周期G1/S進(jìn)展，從而影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力。Gankyrin可能通過(guò)激活PI3K/AKT通路影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。
　　4、Gankyrin可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)