Lin28-miR-107與胃癌細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率在全世界排名第三[1]。我國是胃癌好發(fā)地區(qū)，其年患病率和死亡率均為世界平均水平的2倍多。胃癌患者單純根治術(shù)5年生存率僅為40％左右，即使采用擴(kuò)大根治術(shù)亦未能顯著提高患者術(shù)后生存率，手術(shù)+化療為其最佳治療手段。盡管化療藥物多種多樣，聯(lián)合化療可增加其有效率，而且有新藥的不斷研發(fā)及應(yīng)用臨床，但是中晚期胃癌的5年生存率仍低于30％[2，3]，其中很大部分是由于化療耐藥引起。因此關(guān)于胃

2、癌耐藥的機(jī)制研究，對(duì)進(jìn)一步提高胃癌治療效果具有十分重大的意義。目前認(rèn)為與胃癌耐藥相關(guān)的機(jī)制包括：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性、癌基因p53突變及凋亡相關(guān)通路等等。而腫瘤干細(xì)胞具有活躍的。DNA修復(fù)能力、高表達(dá)三磷酸腺苷結(jié)合金(ATP binding casstte，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體、抗輻射、抗凋亡等特性。因此腫瘤干細(xì)胞也就可能擁有耐藥的特性。研究發(fā)現(xiàn)Lin28是腫瘤干細(xì)胞重要的表面分子標(biāo)記物，其具有能

3、參與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的形成及維持腫瘤干細(xì)胞特性等重要功能。而在Lin28與腫瘤治療療效的研究方面，有研究顯示Lin28可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞放療耐受。但Lin28在胃癌中與化療療效有無關(guān)系，目前尚不明確。我們擬通過以下研究，闡明Lin28與胃癌化療耐藥之間的關(guān)系，并通過體外研究探索其可能的分子機(jī)制，以期更加了解胃癌化療耐藥，并找到其中可能逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在靶點(diǎn)。
　　方法和結(jié)果：
　　1.Lin28表達(dá)與胃癌新輔助化療后病理反應(yīng)的相關(guān)性分

4、析
　　2004年至2011年我科收治有化療前胃鏡標(biāo)本的新輔助化療胃癌患者共47例。將其分為兩組，化療療效病理評(píng)估有反應(yīng)組(0～50％腫瘤細(xì)胞殘留)和化療療效臨床評(píng)估無反應(yīng)組(＞50％腫瘤細(xì)胞殘留)。病理有反應(yīng)率為61.7％(29例)，38.3％(18例)患者化療對(duì)化療無反應(yīng)。卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示Lin28表達(dá)水平和新輔助化療后病理反應(yīng)(0～50％腫瘤細(xì)胞殘留vs.＞50％腫瘤細(xì)胞殘留)具有相關(guān)(P=0.002)，Lin28表達(dá)高

5、的病例的病理反應(yīng)率低，腫瘤細(xì)胞殘留多。結(jié)果提示，術(shù)前胃鏡Lin28高表達(dá)的患者對(duì)化療反應(yīng)性較差，Lin28可以作為預(yù)測(cè)胃癌化療反應(yīng)性的指標(biāo)。值得體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
　　2.穩(wěn)定表達(dá)Lin28胃癌細(xì)胞的構(gòu)建以及Lin28與胃癌細(xì)胞化療敏感性關(guān)系體外研究和機(jī)制探索
　　在胃癌細(xì)胞(MKN28、MKN45、SGC7901、BGC823、AGS、N87)中，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)Lin28蛋白水平的表達(dá)量，結(jié)果提示L

6、in28在六株胃癌細(xì)胞中均沒有表達(dá)。挑選Lin28蛋白表達(dá)陰性胃癌細(xì)胞MKN28、MKN45穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1+-Lin28以及對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1+，轉(zhuǎn)染后兩株細(xì)胞分別標(biāo)記為MKN45/Lin28、MKN45/Vector和MKN28/Lin28、MKN28/Vector。用MTT法比較轉(zhuǎn)染后兩株胃癌細(xì)胞株對(duì)四種化療藥物OXA，PTX，ADM，5-Fu的化療敏感性變化，并用流式細(xì)胞雙染技術(shù)比較在藥物作用后細(xì)胞凋亡的變化

7、。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染lin28后胃癌細(xì)胞株MKN45及MKN28對(duì)OXA，PTX，ADM和5-Fu四種藥物的化療敏感性都降低，凋亡減少。通過siRNA干擾技術(shù)敲低Lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的Lin28表達(dá)，用MTT及流式凋亡檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)能增加Lin28陽性胃癌細(xì)胞的化療敏感性，增加凋亡。
　　用qPCR及Western Blot技術(shù)，檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Lin28的胃癌細(xì)胞株在耐藥基因及耐藥蛋白表達(dá)上的變化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Hn28后可引起C-myc，

8、MDR1/P-gp基因及蛋白的表達(dá)增加，周期蛋白CyclinD1表達(dá)減少；并且可致Caspase9及Caspase3的表達(dá)減少。檢測(cè)siRNA干擾后Lin28陽性細(xì)胞株在mRNA及蛋白水平表達(dá)顯示：敲低Lin28后可致C-mye，MDR1/P-gP的表達(dá)減少，CyclinD1表達(dá)增加。
　　我們推測(cè)Lin28引起化療敏感性變化的機(jī)制可能通過使胃癌細(xì)胞過表達(dá)C-mye，MDR1/P-gP，低表達(dá)CyclinD1有關(guān)。
　　3.

9、miR-107與Lin28基因之間的關(guān)系，Lin28/miR107通路在胃癌細(xì)胞化療敏感性變化中起的作用及其機(jī)制研究。
　　為研究Lin28能否通過miR-107對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，檢測(cè)Lin28穩(wěn)定表達(dá)胃癌細(xì)胞株MKN45/Lin28及MKN28/Lin28中miR-107的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Lin28后細(xì)胞miR-107的表達(dá)明顯下降；而當(dāng)敲低Lin28的表達(dá)后，miR-107的表達(dá)上升。在穩(wěn)定表達(dá)Lin28的細(xì)胞株內(nèi)，導(dǎo)入pre-

10、miR-107后發(fā)現(xiàn)Lin28蛋白及RNA水平表達(dá)的下降。從而證明了miR-107是受Lin28基因調(diào)控的下游靶microRNA之一，miR-107可能參與了Lin28引起胃癌細(xì)胞的化療敏感性變化。
　　將Lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載的細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染pre-miR-107和anti-miR-107，并對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。MTT與流式細(xì)胞技術(shù)的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了pre-miR-107后，可使Lin28陽性胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥

11、物敏感性增加，凋亡增加；而轉(zhuǎn)染anti-miR-107的細(xì)胞變得對(duì)化療藥物敏感性下降。說明miR-107可能在Lin28引起的胃癌細(xì)胞化療敏感性改變中起重要作用。而Western-blot及q-PCR的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pre-miR-107后可導(dǎo)致C-myc，MDR1/P-gP的表達(dá)減少，CyclinD1表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　我們通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)胃鏡Lin28表達(dá)與化療反應(yīng)之間存在聯(lián)系，并可以預(yù)測(cè)新輔助化療患者的化療