Lin28B-Let-7調(diào)控環(huán)路影響結(jié)腸癌化療敏感性的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　結(jié)腸癌為臨床常見惡性腫瘤之一,2010年在美國位列腫瘤死亡率第三位,在我國的死亡率則排在第四~六位,在對近些年我國結(jié)腸癌的發(fā)病率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),總體上呈上升趨勢,雖然結(jié)腸癌患者接受根治性手術治療及輔助性放化療的治療率高達70％~80%,但仍有大量患者死于腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移。導致腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移的原因有很多,其中重要之一就是腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生了耐藥。目前針對腫瘤耐藥的研究已成為腫瘤治療研究領域的一大熱點。Lin28是一個

2、高度保守的小RNA結(jié)合蛋白,其亞型Lin28B在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達明顯升高,而且Lin28B能夠促進結(jié)腸癌腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移。同時Lin28還是腫瘤干細胞的表面分子標記物,能夠誘導多能干細胞形成并維持腫瘤干細胞特性。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌等惡性腫瘤中Lin28能夠抑制Let-7的成熟,高表達Lin28的腫瘤組織中相應的Let-7水平下降。而在肺癌中,Lin28能夠誘導肺癌腫瘤細胞對放療耐受。小分子RNA(microRNA) Let-7能夠促

3、進細胞分化,與Lin28B存在調(diào)控關系,在結(jié)腸癌組織中低水平表達。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn),Lin28B-Let-7與肝癌干細胞密切相關,干細胞在誘導腫瘤耐藥方面起著舉足輕重的作用。而在結(jié)腸癌中對于 Lin28B-Let-7的調(diào)控關系以及其對化療藥物敏感性的影響尚不明確,因此我們擬通過以下的實驗設計,明確Lin28B-Let-7在結(jié)腸癌中的調(diào)控關系,并闡明其對結(jié)腸癌細胞化療敏感性的影響,從而有助于對逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥性關鍵靶點的研究。
　　

4、目的:
　　1、在8種人結(jié)腸癌細胞系中檢測Lin28B的表達,并在人結(jié)腸癌組織中的檢測其表達情況,進而對其定位表達進行觀察;
　　2、在過表達Lin28B的結(jié)腸癌細胞中證實Lin28B-Let-7調(diào)控環(huán)路的存在;
　　3、過表達Lin28B/Let-7,觀察其對化療藥物5-FU敏感性的變化。
　　材料與方法:
　　1、對8種人結(jié)腸癌細胞系進行PCR檢測,觀察Lin28B表達情況;Real-time PCR,

5、Western Blot及免疫組化技術對解放軍總醫(yī)院海南分院21例結(jié)腸癌和19例正常結(jié)腸組織進行檢測,觀察Lin28B表達情況;
　　2、在人結(jié)腸癌細胞系中分別采用免疫熒光法、核漿蛋白分離后行 Western Blot和表達GFP慢病毒載體感染的方法檢測Lin28B的表達定位。在人結(jié)腸癌組織中進行免疫組化染色以進一步確認定位觀察;
　　3、在人結(jié)腸癌細胞系中,分別過表達Lin28B后觀察Let-7的表達情況;反之,過表達Le

6、t-7觀察Lin28B是否受到抑制;最后,檢測過表達Let-7或Lin28B對化療藥物5-FU敏感性的影響。
　　結(jié)果:
　　在結(jié)腸癌細胞系 HCT116、SW620、SW1116、SW480、LOVO、Lim1215、LS174T和DLD1以及結(jié)腸癌組織中均發(fā)現(xiàn)Lin28B有著廣泛的表達,且在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于正常的結(jié)腸組織。繼而,Lin28B的定位表達的實驗結(jié)果觀察到其在細胞核和細胞漿中均有表達,且在細胞漿中呈現(xiàn)

7、高表達。隨后,通過 Real-time PCR和 Western Blot的結(jié)果驗證了Lin28B-Let-7調(diào)控環(huán)路的存在。最后,藥敏試驗結(jié)果顯示過表達Let-7的結(jié)腸癌細胞對5-FU化療藥物的敏感性增加,而過表達 Lin28B的結(jié)腸癌細胞對5-FU化療藥物的敏感性降低。
　　結(jié)論:
　　1、在人結(jié)腸癌細胞系和結(jié)腸癌組織中,Lin28B廣泛的表達,且在腫瘤組織中的表達明顯高于正常的結(jié)腸組織;
　　2、Lin28B在結(jié)