P21WAF1-CIP1泛素化介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116化療敏感性的研究.pdf

1、目的：
　　制備p21WAF1/CIP1基因表達(dá)缺失的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞系，比較HCT-116細(xì)胞及p21缺失的HCT-116-p21-/-細(xì)胞對化療藥物敏感性的差異，比較HCT-116和HCT-116-p21-/-細(xì)胞中p21泛素化表達(dá)的不同，初步探討P21泛素化對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116化療敏感性的影響
　　方法：
　　1.采用siRNA技術(shù)沉默HCT-116細(xì)胞中p21基因表達(dá)，構(gòu)建HCT-116-p2

2、1-/-細(xì)胞，提取HCT-116-p21-/-細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR技術(shù)對siRNA靶區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增，并對靶區(qū)行基因測序,分析可能存在的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，避免因SNP導(dǎo)致siRNA作用失活。
　　2.采用MTT法檢測化療藥物5氟尿嘧啶（5-Fu）、奧沙利鉑（L-OHP）及伊立替康（CPT-11）對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116與HCT-116-p21-/-增殖抑制的影響。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)（Annex

3、in V/PI雙染法）檢測化療藥物5氟尿嘧啶（5-Fu）、奧沙利鉑（L-OHP）及伊立替康（CPT-11）對人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116與HCT-116-p21-/-凋亡的影響。
　　4.采用蛋白印跡法Western Blot檢測經(jīng)化療藥物5氟尿嘧啶（5-Fu）、奧沙利鉑（L-OHP）及伊立替康（CPT-11）對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116與HCT-116-p21-/-細(xì)胞中MDM2、p53及泛素Ub表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：<

4、br>　　1.對HCT-116細(xì)胞siRNA靶區(qū)基因片段進(jìn)行測序，并對結(jié)果進(jìn)行BLAST序列對比，未發(fā)現(xiàn)常見的SNP位點(diǎn)，經(jīng)Western Blot檢測HCT-116-p21-/-細(xì)胞的P21蛋白表達(dá)基本消失，證明實(shí)驗(yàn)采用的siRNA技術(shù)沉默了HCT-116細(xì)胞中p21基因表達(dá)。
　　2.MTT法檢化療藥物對HCT-116細(xì)胞的抑制率為：0.73±0.27（空白對照）、0.34±0.19（5-Fu）、0.12±0.15（L-OHP

5、）、0.23±0.16（CPT-11）；對HCT-116-p21-/-細(xì)胞的抑制率為：0.92±0.25（空白對照）、0.56±0.26（5-Fu）、0.35±0.11（L-OHP）、0.45±0.03（CPT-11）；經(jīng)配對t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.001，化療藥物對HCT-116細(xì)胞的抑制作用更明顯。
　　3.Annexin V/PI雙染法檢測化療藥物對HCT-116細(xì)胞的凋亡率為：0.086±0.027（空

6、白對照）、0.562±0.082（5-Fu）、0.372±0.075（L-OHP）、0.457±0.023（CPT-11）；對HCT-116-p21-/-細(xì)胞的凋亡率為：0.069±0.024（空白對照）、0.305±0.031（5-Fu）、0.377±0.083（L-OHP）、0.266±0.073（CPT-11）；經(jīng)配對t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.001，化療藥物對HCT-116細(xì)胞的凋亡作用更明顯。
　　4.

7、Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測HCT-116-p21-/-及HCT-116細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。未加入化療藥物：HCT-116-p21-/-細(xì)胞中的P53蛋白表達(dá)水平增高，與HCT-116細(xì)胞比較結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.05；HCT-116-p21-/-細(xì)胞中的MDM2蛋白表達(dá)水平下降，與HCT-116細(xì)胞比較結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＜0.05；泛素Ub蛋白表達(dá)水平兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。加入化療藥物作用后，HCT-116-p21-/-及HC

8、T-116細(xì)胞與各自對照組相比較：P53蛋白表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢，與對照組（未加化療藥物）相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而5-Fu作用后兩組細(xì)胞的MDM2蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢，而 CPT-11作用后兩組細(xì)胞的MDM2蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；L-OHP作用后HCT-116細(xì)胞的MDM2蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢，HCT-116-p21-/-細(xì)胞的MDM2蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢。泛素Ub蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：