腺病毒介導(dǎo)p21WAF1-CIP1基因抑制PVR的研究.pdf

1、目的：
　　通過建立兔增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)動(dòng)物模型，探討腺病毒介導(dǎo)p21WAF1/CIP1基因?qū)VR增生的抑制作用及機(jī)制，評價(jià)其治療PVR的效果。
　　方法：
　　1.PVR動(dòng)物模型的建立：青紫藍(lán)兔28只，隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組及對照組各14只。實(shí)驗(yàn)組采用玻璃體腔注射人富含血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)聯(lián)合鞏膜外

2、冷凍建立PVR模型，對照組采用玻璃體腔注射兔PRP建立PVR模型。行間接眼底鏡、B型超聲及HE染色檢查，觀察PVR程度及視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生情況。
　　2.p21WAF1/CIP1在PVR發(fā)病機(jī)制中的作用：青紫藍(lán)兔27只，隨機(jī)分成兩組，正常組3只，實(shí)驗(yàn)組24只。正常組不做任何處理；實(shí)驗(yàn)組每只兔隨機(jī)選取一只眼作為實(shí)驗(yàn)眼，采用玻璃體腔注射人PRP聯(lián)合鞏膜外冷凍建立PVR模型。行蛋白免疫印跡(Western blot，WB)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

3、反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，檢測PVR模型建立后第7d、14d、21d及28d視網(wǎng)膜組織中p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)hRPE407細(xì)胞，細(xì)胞同步化后，分為磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)組、陰性對照(adenovirus m

4、ediated deliveryof non-target control，Ad-NC)組和腺病毒p21WAF1/CIP1載體轉(zhuǎn)染(adenovirusmediated delivery of p21WAF1/CIP1，Ad-p21)組。行WB和RT-PCR檢測p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)；行3-甲基-2-噻唑硫酮(3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-di

5、phenyltetrazolium bromide，MTT)試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀及Transwell檢查。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：青紫藍(lán)兔50只，隨機(jī)分成4組，正常對照組2只，PBS組、Ad-NC組及Ad-p21組各16只。其中PBS組、Ad-NC組及Ad-p21組按照前述方法建立PVR模型。正常組不做任何處理，PBS組、Ad-NC組及Ad-p21組于建模后第7 d玻璃體腔分別注入PBS、Ad-NC及Ad-p215ul。第14 d時(shí)，行W

6、B和RT-PCR檢測p21WAF1/CIP1、CDK2、cyclin E蛋白及mRNA在視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)。行間接眼底鏡、B型超聲及HE染色，觀察第28 d各組PVR程度及視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生情況。
　　結(jié)果：
　　1.建模后觀察28 d，實(shí)驗(yàn)組20眼均發(fā)生了視網(wǎng)膜脫離，發(fā)生率為100％；對照組，13眼發(fā)生了視網(wǎng)膜脫離，發(fā)生率為65％，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.WB和RT-PCR檢測結(jié)果顯示，PVR模

7、型建立后7d、14d、21d及28d視網(wǎng)膜組織內(nèi)p21WAF1/CIP蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于正常組，第14 d時(shí)表達(dá)最低(P<0.01)，而CDK2、cyclin E表達(dá)均高于正常組，在第14 d時(shí)表達(dá)水平最高(P<0.01)。
　　3.WB和RT-PCR檢測結(jié)果顯示在Ad-p21組，p21WAF1/CIP蛋白和mRNA的表達(dá)均增高，說明腺病毒成功介導(dǎo)p21WAF1/CIP基因轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)。MTT檢測

8、細(xì)胞轉(zhuǎn)染p21WAF1/CIP基因48 h后其增生抑制率達(dá)到43.13％，較其它組細(xì)胞生長速度減慢。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，Ad-p21組處于G0/G1期的細(xì)胞所占百分比顯著高于PBS及Ad-NC組(P<0.01)。Transwell小室檢測結(jié)果顯示Ad-p21組穿膜細(xì)胞數(shù)，明顯低于PBS及Ad-NC組(P<0.01)。
　　4.間接眼底鏡及B超結(jié)果顯示PBS組、Ad-NC組及Ad-p21組第28d視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率分別為100％、

9、91.67％和33.33％。建模后第14 d時(shí)，WB和RT-PCR顯示Ad-p21組p21WAF1/CIP1蛋白及mRNA的表達(dá)顯著高于正常組、PBS組及Ad-NC組(P<0.01)，而CDK2、cyclin E表達(dá)明顯低于其它組(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.采用玻璃體腔注射人PRP聯(lián)合鞏膜外冷凍可成功建立了PVR動(dòng)物模型，視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率為100％。
　　2.p21WAF1/CIP1基因在PVR發(fā)病機(jī)制中