腺病毒載體介導的RNAi抑制肺間質纖維化大鼠TGF-β1基因表達的研究.pdf

1、背景
　　 纖維化可導致器官結構破壞和功能減退、乃至衰竭。肺間質纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是由多種因素引起的一組肺間質彌漫性疾病，是異質性疾病，也是多種肺疾病的共同結局，其發(fā)病機制復雜，研究證實肺間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展與轉化生長因子-β1(TGF-β1)的高表達密切相關。
　　 轉化生長因子-β1(TGF-β1)是公認的肺間質纖維化形成和發(fā)展中的“開關性”細胞因子，作為一種多功能及強效的致纖維化

2、因子，參與調控細胞的分化、增殖及細胞外基質(extracellular membrane)分泌，增加ECM的聚積并抑制其降解，在肺纖維化形成過程中主要作用于膠原的轉錄和翻譯過程，誘導前膠原mRNA的產生，促進膠原蛋白的形成和沉積，是纖維化發(fā)生過程中最直接的一種細胞因子。抑制TGF-β1基因表達顯然有助于延緩肺纖維化進程，而應用常規(guī)抗纖維化藥物抑制其表達的效果并不理想。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi

3、)是新近出現的一種分子生物學技術，它通過導入由對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，誘導受體細胞中與其有同源序列的特異性靶mRNA降解，阻止蛋白質的翻譯過程，其作用類似于基因敲除，但基因表達并未永遠消除，因而又被稱為“基因沉默”。
　　 目的
　　 本研究針對大鼠TGF-β1的mRNA序列設計、合成并構建具有特異性阻斷大鼠轉化生長因子β1(TGF-β1)基因的TG

4、F-β1siRNA Shuttle載體，然后重組入腺病毒載體，包裝成轉化生長因子受體β1(TGF-β1)siRNA的腺病毒，將腺病毒載體局部轉染肺間質纖維化大鼠，觀察并分析其對TGF-β1mRNA表達的抑制作用，為肺纖維化的防治提供實驗依據。
　　 材料和方法：
　　 60只SD雄性大鼠，生理鹽水對照組、重組復制缺陷型TGF-β1腺病毒治療組、空載體對照組，第0d經氣管滴入0.3ml的博來霉素(BLM3mg/kg)建立肺

5、間質纖維化模型，空白對照組大鼠滴注等體積生理鹽水，治療組于滴入博來霉素24h后經鼻滴入重組復制缺陷型TGF-β1腺病毒(AdCMV TGF-β1)10×109空斑形成單位(pfu)(100μl/鼠)，生理鹽水組于造模后24h經鼻滴入同體積的生理鹽水，同時設立無外源活性基因的復制缺陷型腺病毒(AdCMVNull)空載體對照組，空白對照組于24h給予氣管內滴入同體積生理鹽水。各組動物于7、14、28d隨機處死5只，取肺組織肺行蘇木精伊紅(H

6、E)染色；免疫組化法檢測肺組織TGF-β1的蛋白表達水平；熒光定量PCR檢測肺組織中TGF-β mRNA的表達水平；ELISA法檢測血清中TGF-B的蛋白的表達水平，評價其對全身的影響。
　　 結果：
　　 HE染色示治療組各時期肺泡炎和肺纖維化程度均較生理鹽水對照組及空載體對照組輕；免疫組化結果顯示治療組與生理鹽水及空載體對照組相比肺組織TGF-β1蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實時熒光定量PCR