TGF-β受體亞型糖基化修飾對肺間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的影響.pdf

1、特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IdiopathicPulmonaryFibrosis，IPF）嚴重威脅人類健康和生命，其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，死亡率高。由于其發(fā)病機制不十分清楚，目前尚無有效的治療方法。雖然肺組織已形成的纖維化不可逆轉(zhuǎn)，但肺間質(zhì)纖維化是一個慢性的、進行性的病理反應過程，探索肺間質(zhì)纖維化發(fā)病的分子機制及新的干預靶點以延緩或阻止肺纖維化進展的策略，仍具有重要的實際意義，是國際肺科學界一直關(guān)注的焦點。在肺纖維化的發(fā)展過程中，轉(zhuǎn)化生長因子

2、-β(Transforminggrowthfactorβ，TGF-β)起著關(guān)鍵作用。活化的TGF-β，在Ⅲ型受體的調(diào)節(jié)作用下，首先與肺成纖維細胞膜上的2個Ⅱ型受體結(jié)合，再募集2個Ⅰ型受體形成復合體，磷酸化Ⅰ型受體的激活型G蛋白(stimulatoryGprotein，Gs)功能域，成為活化狀態(tài)，活化的Ⅰ型受體進一步磷酸化下游信號分子Smads蛋白。但具體哪幾個TGF-βⅠ型受體亞型參與肺纖維化的過程尚不清楚。通過基因芯片技術(shù)，我們對博來

3、霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中7個TGF-βⅠ型受體亞型(又稱活化樣受體樣激酶，activinreceptor-likekinase，ALK)的研究發(fā)現(xiàn):ALK4，ALK5，ALK7表達增高，為進一步明確以上三種TGF-βⅠ型受體亞型肺間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展中的分布和變化規(guī)律，我們應用實時定量PCR和蛋白免疫印記、免疫組化技術(shù)分析ALK4，ALK5和ALK7在纖維化不同時期的表達變化。
　　 對ALK5的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)其表面存在核心巖

4、藻糖基化修飾位點，TGF-βRⅡ也屬于糖蛋白，它須經(jīng)過由α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移(α1，6-fucosyltransferase8，F(xiàn)UT8)催化的核心巖藻糖基化修飾，然后才具備與TGF-β1結(jié)合的功能。因此，F(xiàn)UT8是TGF-β受體糖基化修飾的重要酶。FUT8還可以促進間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)沉積，對纖維化的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要作用。而FUT8在肺間質(zhì)纖維化中的研究少見報道。我們利用TGF-β1誘導的人肺成纖維細胞WI-38纖維化模型，來

5、研究兩種受到核心糖基化修飾的TGF-βRⅠ(ALK5)和TGF-βRⅡ，探討它們的糖基化修飾作用是否參與了TGF-β1誘導的肺間質(zhì)纖維化過程。
　　 IPF不僅病因譜極為廣泛和復雜，同時在進展過程中存在多個病理生理過程參與、多個信號通路活化，因此，從理論上來講，其治療也應該是多靶點的，單一阻抑某一個靶點，或某一種發(fā)病機制，或某個信號傳導通路可能獲得部分療效，但不能最終阻止肺纖維化的進展。而蛋白質(zhì)的糖基化修飾可以作用于多個蛋白靶點

6、，從而實現(xiàn)疾病狀態(tài)下的多靶點的同時調(diào)控。目前國內(nèi)外治療IPF的傳統(tǒng)方法是糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，療效不佳。多味中藥聯(lián)合因其化學成分多樣，藥理活性廣泛，作用多靶點及多效性、意向性及毒副作用小等特點，非常符合多靶點治療肺纖維化策略?；钛龇橹嗅t(yī)學八大治則之一，眾多醫(yī)家嘗試用血府逐瘀湯等這些方劑學中有名的活血化瘀方劑治療肺纖維化，均取得了不錯的療效。組方中當歸等可以干擾TGF-β/Smad2/3信號通路對基因表達、蛋白合成的調(diào)節(jié)，實現(xiàn)對大

7、鼠肺纖維化的治療作用。而在TGF-β/Smad2/3信號通路中，受體的糖基化修飾是TGF-β發(fā)揮重要生物學作用的關(guān)鍵步驟。我們應用現(xiàn)代醫(yī)學手段去探討活血化瘀方劑對TGF-β受體糖基化修飾的影響，為活血化瘀方劑治療肺間質(zhì)纖維化提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：
　　 探討ALK4，ALK5，ALK7在博來霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化中的表達
　　 目的:明確TGF-βⅠ型受體亞型(ALK4，ALK5，ALK7)在正常大鼠肺

8、組織和博來霉素誘導的大鼠肺間質(zhì)纖維化肺組織中的分布和變化規(guī)律;探討特異性TGF-βⅠ型受體亞型在肺間質(zhì)纖維化中的表達，綜合分析TGF-βⅠ型受體亞型在肺間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展中的分布和變化規(guī)律，為防治肺間質(zhì)纖維化提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:雌性SD大鼠56只，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組（N組）和肺間質(zhì)纖維化模型組（1，3，7，14，28，35天組），每組7只。對肺組織進行石蠟包埋組織學檢測，同時應用實時定量PCR和蛋白免疫

9、印記、免疫組化技術(shù)分析ALK4，ALK5和ALK7在纖維化不同時期的表達變化。
　　 結(jié)果:ALK-4、ALK-5和ALK-7mRNA和蛋白表達于第1天出現(xiàn)上升并隨纖維化時間延長逐漸增高，ALK-4于14天達到最高峰，在第28天有所回落，而ALK-5和ALK-7于28天達到最高峰，在第35天有所回落。免疫組化可見ALK4，ALK5和ALK7在正常和纖維化時的肺泡上皮細胞，成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞上均有表達。
　　 結(jié)論:

10、ALK4，ALK5和ALK7均在肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中高表達。
　　 第二部分：
　　 探討FUT8對肺間質(zhì)纖維化ALK5/TGF-βRⅡ/Smad2/3轉(zhuǎn)導通路的影響
　　 目的:利用TGF-β1誘導的肺成纖維細胞肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化模型，研究兩種TGF-β受體—TGF-βRⅡ和TGF-βRⅠ(ALK5)核心巖藻糖基化修飾，探討它們的糖基化修飾作用是否參與了TGF-β1誘導的人胚胎肺成纖維細胞(human

11、embryoniclungfibroblastsWI-38)細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化;阻斷TGF-β受體的糖基化修飾是否可以阻斷Smad2/3信號轉(zhuǎn)導，減少其下游MMP-9，TIMP-1的表達。
　　 方法:體外培養(yǎng)的WI-38細胞隨機分為六組:(1)N組，單獨的DMEM培養(yǎng);(2)FUT8-siRNA組，轉(zhuǎn)染FUT8-siRNA并持續(xù)孵育72h;(3)TGF組，加入濃度為10ng/ml的TGF-β1孵育48h;(4)TGFM組，

12、首先用亂序siRNA轉(zhuǎn)染細胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h;(5)TGFFs組，先用FUT8-siRNA轉(zhuǎn)染細胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h;(6)TGFFsF組，F(xiàn)UT8-siRNA轉(zhuǎn)染細胞并孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β148h后加入;加入Fut8蛋白5ng/ml繼續(xù)孵育24小時。我們用免疫熒光的方法確定了WI-38細胞表面有豐富的核心巖藻糖鏈表達，然后

13、用流式細胞儀檢測a-SMA，用實時定量PCR技術(shù)，免疫印記技術(shù)、免疫熒光檢測FUT8-siRNA干擾后各組細胞的ALK5，TGF-βRⅡ和核心巖藻糖鏈表達，用實時定量PCR技術(shù)、免疫印記技術(shù)檢測p-Smad2/3，MMP-9，TIMP-1的變化。
　　 結(jié)果:加入TGF-β1導致WI-38細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學改變，可見細胞肥大、拉長;TGF-β1刺激能夠增加WI-38細胞FUT8-siRNA以及蛋白表達水平，能激活TGF-β/S

14、mad2/3信號轉(zhuǎn)導途徑，上調(diào)TGF-β-RⅡ和ALK5蛋白表達水平，最終導致WI-38細胞中p-Smad2/3表達水平升高;FUT8-siRNA可以一定程度的抑制由于TGF-β1所致肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的形態(tài)學變化，與對照組相比，TGFF組細胞基本保持正常的成纖維細胞形態(tài);FUT8-siRNA能有效抑制p-smad2/3過表達，F(xiàn)UT8-siRNA能抑制TGF-βRⅡ和ALK5的核心糖基化表達水平，但對由于TGF-β1所致的二者蛋白增

15、高沒有影響;FUT8-siRNA能夠明顯削弱由TGF-β1導致的WI-38細胞的α-SMA，MMP-9和TIMP-1的高表達，以上的抑制作用可以通過加入外源性FUT8緩解。
　　 結(jié)論:沉默F(xiàn)UT8基因能夠抑制TGF-βRⅡ和ALK5的核心巖藻糖基化修飾，導致致纖維化細胞因子途徑TGF-β/Smad2/3信號轉(zhuǎn)導途徑的激活受到抑制，最后使抑制WI-38細胞的肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，并使TGF-β/Smad2/3下游的α-SMA，M

16、MP-9和TIMP-1的表達。這些發(fā)現(xiàn)為我們進一步認識肺間質(zhì)纖維化的翻譯后修飾機制提供了線索，可能成為一種新的抗肺間質(zhì)纖維化的治療策略。
　　 第三部分：
　　 探討活血化瘀方劑對肺成纖維細胞TGF-β/Smad2/3糖基化修飾的影響
　　 目的:明確活血化瘀方劑是否影響TGF-β/Smad2/3信號通路中TGF-β受體糖基化修飾，用現(xiàn)代醫(yī)學手段闡明活血化瘀方劑治療肺間質(zhì)纖維化的機理。
　　 方法:WI-

17、38細胞隨機分為三組:(1)N組，單獨的DMEM培養(yǎng);(2)TGF組，加入濃度為10ng/ml的TGF-β1孵育48h;(3)TGFH組，先用10％含藥血清孵育24h，然后加入10ng/mlTGF-β1繼續(xù)孵育48h，應用熒光定量PCR、免疫熒光、免疫印記技術(shù)檢測WI-38細胞的FUT8、細胞的巖藻糖基化水平，TGF-β受體ALK5及TGF-βRⅡ的表達，應用ELISIA技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維(collagenⅠ、Ⅲ、

18、Ⅳ，COLⅠ、Ⅲ、Ⅳ)和FN的變化。
　　 結(jié)果:活血化瘀方劑能明顯地抑制WI-38細胞的FUT8的表達和細胞的巖藻糖基化水平，活血化瘀方劑對TGF-β受體ALK5及TGF-βRⅡ的表達無明顯影響，但可以減少TGF-β1對WI-38細胞p-Smad2/3的影響，使其表達降低。COLⅠ在TGF組中表達約為正常組的1.5倍，TGFH組略高于正常組;COLⅢ在TGF組中表達約為正常組的2.5倍，TGFH組略高于正常組;COLⅣ在TGF