巖藻糖基化修飾對TGF-β誘導的人腎小管上皮細胞ECM積聚的影響.pdf

1、目的：探討α-1，6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1，6fucosyltransferase，F(xiàn)ut8)對TGF-β1誘導的人近端腎小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial cells，HK-2)細胞外基質(zhì)積聚的影響。
　　 方法：(1)實驗分組：體外培養(yǎng)的正常HK-2細胞分為正常對照組（CON組），DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；Mock組，用脂質(zhì)體法將對照的Fut8-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染進HK

2、-2細胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激組(TGF組)，向DMEM細胞培養(yǎng)液中加入濃度為10ng/ml的TGF-β1刺激細胞；TGF+Mock組（TGFM組），脂質(zhì)體法將對照的Fut8-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染進HK-2細胞，之后再加入TGF-β110ng/ml刺激細胞；Fut8-siRNA干預(yù)組（Fut8-siRNA組），脂質(zhì)體法將Fut8-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染進HK-2細胞，

3、沉默F(xiàn)ut8基因；TGF+Fut8-siRNA組(TGFF組)，脂質(zhì)體法Fut8-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染進HK-2細胞，沉默F(xiàn)ut8基因，之后再加入TGF-β110ng/ml刺激細胞。(2)采用Western blot方法檢測Fut8在各組中的表達。(3)采用流式細胞術(shù)檢測各組中細胞凋亡情況。(4)采用Western blot方法檢測各組中基質(zhì)金屬蛋白酶2，3，9(Matrix metalloproteinase2，3，9，MMP-2，3，

4、9)和組織金屬蛋白酶抑制劑1(Tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1)蛋白水平的變化。(5)采用免疫熒光方法檢測Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原的變化。(6)采用Real-time PCR方法檢測纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，，LN)的變化。
　　 結(jié)果：(1)Western blot方法結(jié)果顯示，與CON組相比，F(xiàn)ut8在TGF組和TGFM組中

5、表達增高(P＜0.05)，在Fut8-siRNA組和TGFF組中表達下降(P＜0.05)。(2)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，TGF組相比CON組細胞凋亡增加(P＜0.05)，TGFF組細胞凋亡低于TGF組(P＜0.05)。(3)Westernblot方法結(jié)果顯示，各組中MMP-2，3，9均有表達，與CON組相比，MMP-2，3在TGF組表達略有增加(P＜0.05)，MMP-2，3，9在TGFF組中表達明顯增加(P＜0.01)，TIMP-1在各組

6、中均有表達，在TGF組表達上調(diào)(P＜0.05)，在TGFF組中表達低于TGF組(P＜0.01)。(4)免疫熒光結(jié)果顯示，與CON組相比，在TGF組中Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原的熒光強度均明顯增加(P＜0.05)，TGFF組中熒光強度與CON組無顯著差異，與TGF組相比熒光強度減低(P＜0.05)。(5)Real-timePCR結(jié)果顯示，與CON組相比，在TGF組中纖維連接蛋白和層粘連蛋白的表達均增加(P＜0.05)，TGFF組中的表達低于TG