Sirt1過表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞株凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病終末期的共同特征。腎小管上皮細(xì)胞可通過多種方式主動參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。在多種腎臟疾病的動物模型以及人體多種腎臟疾病病理標(biāo)本上發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)纖維化愈重的地方，細(xì)胞凋亡數(shù)量愈多，間質(zhì)纖維化程度與細(xì)胞凋亡數(shù)量成正相關(guān)。本研究著重觀察Sirt1過表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究。
　　方法:將體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞分為正常對照組、TGF-β1刺激組及TGF-β1+Sirt1過

2、表達(dá)組。采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞術(shù)及hoechst33258染色法分別檢測細(xì)胞凋亡百分比;Western blot檢測Sirt1、CTGF、Bax、Bcl-2的表達(dá);real time-PCR檢測Sirt1、CTGF、Bax、Bcl-2mRNA水平;活性比色法檢測Sirt1活性;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Sirt1表達(dá)。
　　結(jié)果:①TGF-β1對人腎小管上皮細(xì)胞Sirt1蛋白及mRNA表達(dá)水平的影

3、響:較正常對照組相比，TGF-β1刺激人腎小管上皮細(xì)胞Sirt1mRNA及蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.01）。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，Sirt1主要表達(dá)于人腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，對照組呈強(qiáng)表達(dá)，TGF-β1刺激組的Sirt1表達(dá)顯著低于正常對照組。②TGF-β1對Sirt1活性的影響:活性比色法定量檢測顯示TGF-β1刺激人腎小管上皮細(xì)胞Sirt1活性較正常對照組顯著降低(P＜0.01）。③轉(zhuǎn)染Sirt1質(zhì)粒后人腎小管上皮細(xì)胞Sirt蛋

4、白、mRNA及活性的改變:Sirt1mRNA、蛋白表達(dá)及活性在Sirt1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組人腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著升高(P＜0.01），表明Sirt1基因成功導(dǎo)入了人腎小管上皮細(xì)胞，并在蛋白水平獲得高效表達(dá)。④Sirt1過表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF升高及小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)影響:與正常對照組相比，TGF-β1刺激人腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2水平顯著降低（P＜0.01），Bax、CTGF水平顯著升高(P＜0.01)。Sirt1過表達(dá)能夠顯

5、著上調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的Bcl-2減少（P＜0.01），降低TGF-β1誘導(dǎo)的Bax、CTGF的增多(P＜0.01）。⑤Sirt1過表達(dá)對TGF-β1誘導(dǎo)的人小管上皮細(xì)胞凋亡百分比影響:Hoechst、TUNEL及FCM三種檢測細(xì)胞凋亡技術(shù)均顯示，與正常對照組相比，在TGF-β1刺激下，人腎小管上皮細(xì)胞凋亡百分比顯著增加(P＜0.01);與TGF-β1刺激組相比，Sirt1過表達(dá)能夠顯著減少TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡百分比(P＜0.05

6、)。
　　結(jié)論:
　　1在TGF-β1刺激人腎小管上皮細(xì)胞時CTGF表達(dá)明顯升高，Sirt1表達(dá)顯著下降，同時細(xì)胞凋亡明顯增加。這些結(jié)果提示TGF-β1/CTGF信號傳導(dǎo)途徑及Sirt1下降可能因為與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)而參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程。
　　2 Sirt1過表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡，并且改善CTGF水平升高，提示Sirt1過表達(dá)保護(hù)作用的實現(xiàn)可能是部分通過抑制CTGF實現(xiàn)的。