雷帕霉素對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TSP-1、VEGF和TGF-β1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:腎間質(zhì)纖維化是各種原因造成的腎小管及腎間質(zhì)病變的最終結(jié)果,是所有慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程,該過程涉及腎小管上皮及間質(zhì)的損傷,細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,炎性細(xì)胞的浸潤,成纖維細(xì)胞的增殖,細(xì)胞外基質(zhì)的增多等一系列相互關(guān)聯(lián)的過程,涉及多種細(xì)胞因子的參與。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor TGF-β1)是研究最多也是最重要的致纖維

2、化因子。其可通過促進(jìn)基質(zhì)成份大量產(chǎn)生,以及趨化和活化炎性細(xì)胞,介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,導(dǎo)致腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化,最終發(fā)展至終末期腎衰竭。血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1 TSP-1)作為多肽類內(nèi)源性血管新生抑制物中重要的一員,其可抗血管新生,進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。近年的研究發(fā)現(xiàn),TSP-1能激活內(nèi)皮細(xì)胞分泌潛在的TGF-β,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長。TSP-1作為一種體內(nèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-

3、β1)活化因子,在腎臟疾病中的重要作用越來越受到關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF),具有營養(yǎng)、活化、促進(jìn)血管生成的性能,對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖有著不可或缺的作用。近年的研究發(fā)現(xiàn),VEGF與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系亦較為密切。Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen)是腎間質(zhì)纖維化的重要細(xì)胞外基質(zhì)成分,Ⅰ型膠原的過度表達(dá)是形成腎臟間質(zhì)纖維化、腎小球硬化的過程中的一個重要環(huán)節(jié)。雷帕霉素(

4、rapamycin,RAP)是由鏈球菌屬產(chǎn)生的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗免疫抗生素,目前雷帕霉素主要是作為一種免疫抑制劑用于器官移植后的患者,包括腎移植術(shù)后。近年來的研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素對延緩CKD的進(jìn)展也可能發(fā)揮非常有益的作用,其很可能會成為治療CKD、延緩腎功能損害進(jìn)展的一個有潛力的藥物。
　　 本課題擬通過建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethralobstruction,UUO)誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化模型,結(jié)合免疫組織

5、化學(xué)等檢測手段,觀察雷帕霉素對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中TSP-1、VEGF、TGF-β1及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響,探討雷帕霉素對腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用,為臨床防治腎間質(zhì)纖維化提供試驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 選擇清潔級SD大鼠54只(雄性),體重(200±20)克,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為三組:對照組(A組),UUO模型組(模型組,B組)和雷帕霉素治療組(治療組,C組),每組各18只。每組又分別于術(shù)后第3、7、14

6、天分批取出梗阻側(cè)腎組織,分別為N3、N7、N14組,每組各6只。B、C組大鼠以水合氯醛(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉。無菌條件下于左側(cè)背部脊柱旁1.5 cm、肋下1 cm行縱形切口,逐層分離,沿左腎下極尋找左側(cè)輸尿管,為預(yù)防發(fā)生逆行性感染,在左側(cè)輸尿管中上1/3處分別結(jié)扎上下兩處,然后從中剪斷。A組不結(jié)扎、剪斷輸尿管,余過程同前。各組于手術(shù)前l(fā)天開始給藥,每天灌胃1次,每周復(fù)查體重,調(diào)整給藥量。治療組以雷帕霉素2 mg/kg/d灌胃

7、,對照組及模型組以等容的生理鹽水灌胃,實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食水。各組分別于術(shù)后第3天、7天、14天隨機(jī)選取6只大鼠分三批取出梗阻側(cè)腎組織,置于固定液中,分別采用蘇木素伊紅(HE)染色、Masson染色觀察各組大鼠腎組織病理變化,并采用免疫組織化學(xué)方法測定腎間質(zhì)TSP-1、VEGF、TGF-β1及Ⅰ型膠原的表達(dá),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,采用多因素方差分析,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)

8、據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 光鏡下,HE染色A組未見異常,B組在術(shù)后3天可見腎小管輕度擴(kuò)張,腎間質(zhì)可見炎癥細(xì)胞局部浸潤;第7天腎小管明顯擴(kuò)張,可見腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死,腎間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤,腎間質(zhì)寬度明顯增加;第14天可見較多萎縮的腎小管,腎小管基底膜彌漫性增厚、皺縮,伴有不同程度的斷裂。Masson染色A組未見異常,B組在術(shù)后3天可見腎小管輕度擴(kuò)張,膠原纖維增加;術(shù)后7天

9、及14天,腎小管擴(kuò)張程度逐漸加重,膠原纖維明顯增多,間質(zhì)纖維化明顯。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:TGF-β1在A組無或僅在腎小管上皮細(xì)胞中有微量表達(dá);在B組隨梗阻時間延長,其表達(dá)進(jìn)行性升高,與A組同時相點(diǎn)相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);在C組,TGF-β1的表達(dá)與同期B組相比均有所降低(P＜0.05),但仍高于同期A組(P＜0.05)的表達(dá)。TSP-1在A組無表達(dá);在B組廣泛表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿,且隨著梗阻時間的延長,表達(dá)逐漸增多,與

10、A組相比,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在C組,TSP-1的表達(dá)與同期B組相比均有所降低(P＜0.05),但仍高于同期A組(P＜0.05)的表達(dá)。Ⅰ型膠原在A組僅少量表達(dá)于腎間質(zhì)及腎臟較大的血管壁中;在B組廣泛表達(dá)于腎小管及腎間質(zhì),且隨著梗阻時間的延長,表達(dá)逐漸增多,與A組相比,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Ⅰ型膠原在C組各時期的表達(dá)與同期B組相比均有所降低(P＜0.05),但仍高于同期A組的表達(dá)(P＜0.05)。VEGF在A組各時期廣

11、泛表達(dá)于腎小球臟層上皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞;在B組于第3天表達(dá)升高,與A組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),隨著腎間質(zhì)病變的加重,其表達(dá)漸漸減少,第14天僅在少許的腎小管上皮細(xì)胞中有表達(dá),與A組相比,第7天、第14天的表達(dá)均低于同期A組(P＜0.05);在C組,VEGF于術(shù)后第3天的表達(dá)與同期B組相比無明顯差別,與A組相比有所升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而第7天、第14天VEGF的表達(dá)均高于同時期B組的表達(dá)(P＜0.05),但均

12、低于同期A組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)中,TSP-1、TGF-β1及Ⅰ型膠原的表達(dá)隨著梗阻時間的延長、腎小管間質(zhì)病變程度的加重而逐漸增加,而VEGF的表達(dá)隨著梗阻時間的延長逐漸降低,最終出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化。雷帕霉素可抑制腎間質(zhì)纖維化大鼠TSP-1、TGF-β1及Ⅰ型膠原的過度表達(dá),促進(jìn)VEGF的表達(dá),從而能夠改善UUO大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化,減輕腎小管擴(kuò)張,并減少腎小管間質(zhì)膠原的沉積