TSP1與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性及其對TGF-β1活化調(diào)控作用的研究.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化是終末期腎病的突出表現(xiàn)，其對疾病的進(jìn)展和預(yù)后影響較大。在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)始終是人們的研究熱點(diǎn)，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β 1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)被認(rèn)為是致纖維化的重要因子。但TGF-β1必須經(jīng)活化后才能發(fā)揮其病生理作用。血小板反應(yīng)蛋白1(Thrombospotldinl，TSPl)是大分子糖蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)成員之一。在致病因子誘導(dǎo)下，TSPl可由腎小

2、管上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞等細(xì)胞分泌，介導(dǎo)TGF-β1的活化，并促細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成等作用，因此TSPl已成為這一研究領(lǐng)域中新的熱點(diǎn)。本課題重點(diǎn)探討TSPl與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系及其對TGF-βl活化的調(diào)控作用。 本研究首先觀察TSPl在大鼠纖維化腎組織中的表達(dá)，以及血管緊張素Ⅱ(AngiotensinII，AⅡ)受體阻斷劑纈沙坦及AⅡ轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)雷米普利對腎

3、小管間質(zhì)區(qū)TSPl表達(dá)的影響。建立5／6腎切除SD大鼠模型，設(shè)假手術(shù)組，手術(shù)組，氨氯地平組，纈沙坦組，雷米普利組。通過免疫組化觀察TSPl、FGF-βl、纖維連接蛋白(FibroIlectin，F(xiàn)N)在各組大鼠腎組織中表達(dá)及分布；采用免疫熒光共染技術(shù)觀察TSPl／TGF-β1兩者共區(qū)域表達(dá)隨病變進(jìn)展的變化；抽提腎皮質(zhì)組織總RNA，RT-PCR法檢測TSPl、FGF-β1和FN mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。并將TSPl表達(dá)水平與各組大鼠血肌酐

4、(SCr)和內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)進(jìn)行比較。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞是TSPl的主要來源，在慢性小管間質(zhì)損傷區(qū)，隨病變進(jìn)展，TSPl蛋白質(zhì)分子過度表達(dá)，并與腎小管間質(zhì)病變程度正相關(guān)(p<0.05)。此外，TSPl、TGF-β1和FN的表達(dá)量成正比(p

5、間和地點(diǎn)規(guī)律，拮抗AII能減少TSPl和TGF-β1在纖維化腎組織中的表達(dá)，從而進(jìn)一步對細(xì)胞外基質(zhì)的沉積進(jìn)行調(diào)節(jié)。 本研究第二部分觀察了根據(jù)TSPl分子WSHw序列人工合成的六肽(GGWSHW，G肽)，對AII誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1過度活化的抑制作用。我們以AII刺激HK-2細(xì)胞，10μmol／L G肽進(jìn)行干預(yù)，分別應(yīng)用定量RT-PCR和Westernb1ot檢測TSPl和FGF-β1以及細(xì)胞外基質(zhì)FN和纖溶酶原活化物抑

6、制劑-1(PAI-1)mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)；共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察TSPI和TGF-β1的表達(dá)以及兩者共表達(dá)；ELISA法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液中包括活性TGF-βl的總TGF-β1以及FN和PAl一1的分泌含量，另通過Western blot檢測TGF—β l信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad2及磷酸化Smad2(p—Smad2)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)G肽對TSPI和TGF—β ImRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均影響不大，且對總TGF-β1分泌無明顯抑

7、制作用，但可顯著抑制活性TGF一β1的水平。此外與Losartan組比較，G肽處理組p-Smad2蛋白表達(dá)減少28.9％，且細(xì)胞上清液中FN和PAl一1含量分別減少11％和8.9％。上述結(jié)果表明，TSPI肽抑制物體外能有效通過競爭抑制TSPI致HK一2細(xì)胞的TGF—β1活化作用，并可相應(yīng)下調(diào)致纖維化相關(guān)成分FN和PAI一1的合成分泌。 本研究第三部分觀察了針對TSPI的小雙鏈干擾RNA(SiRNA—TSPI)，抑制由All誘導(dǎo)

8、的腎小管上皮細(xì)胞TGF—β1過度活化。將根據(jù)人TSPI基因序列設(shè)計的特異siRNA—TSPI轉(zhuǎn)染人。腎小管上皮細(xì)胞系(HK一2)，利用Western印跡、RT—PCR、流式細(xì)胞儀及ELISA等方法，檢測了TSPI、TGF—β1及其信號蛋白Smad2與p-Smad2、FN和PAl—l的基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)表達(dá)或蛋白質(zhì)活性。結(jié)果顯示，siRNA—TSPI能有效轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，并以劑量依賴方式顯著抑制TSPI的基因轉(zhuǎn)錄與合成；其對TGF—β

9、l的合成影響較小，但能明顯抑制TGF—β1的活化。此外siRNA—TSPI可阻抑TGF—β1依賴的Smad2磷酸化，減少細(xì)胞外基質(zhì)FN以及PAl一1的合成。研究結(jié)果提示，由于TSPI是TGF—β1重要的內(nèi)源性活化因子，故針對TSPI的RNA干擾能在體外有效抑制TSPI表達(dá)并相應(yīng)調(diào)抑了TGF一β1的活化。 為進(jìn)一步了解AII誘導(dǎo)TSPl分泌合成的機(jī)制，本研究第四部分首先從轉(zhuǎn)錄水平探討All對HK一2細(xì)胞中TSPI基因啟動子活性的調(diào)

10、控作用，以及蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)及絲裂原激活蛋白激酶(mitogen—activated protein）kinase，MAPK)途徑對該作用的影響；其次研究與AII誘導(dǎo)TSPI合成相關(guān)的信號途徑及轉(zhuǎn)錄因子活性。我們首先構(gòu)建含人類TSPI基因啟動子全長序列的報告基因重組體pTSP—luc，將其瞬時轉(zhuǎn)化HK-2細(xì)胞，通過檢測熒光素酶的活性反映TSPI基因啟動子活性。結(jié)果證實(shí)AII以劑量依賴方式上調(diào)HK一2細(xì)胞中TSP

11、1基因啟動子的活性。應(yīng)用H89、GO6850、PD98059、SB203580和SP600125分別特異性抑制PKA、PKC通路，以及MAPK途徑的胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignal—regulated protein kinase，ERK)通路、蛋白激酶p38(p38 MAP kirlaseinhibitot．p38 MAPK)通路和c—Jun一氨基末端激酶(c—jun N—terminal kinase，J

12、NK)通路，我們發(fā)現(xiàn)在HK-2細(xì)胞中這五條途徑對AII上調(diào)TSPI啟動子活性、mRNA轉(zhuǎn)錄，以及TSPI蛋白合成的作用有不同影響。除JNK通路外，其余通路抑制劑皆能顯著下調(diào)AII誘導(dǎo)的pTSP—luc活性，減少TSPImRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。此外，PKC、PKA抑制劑能顯著下調(diào)ERK的磷酸化，上述三者對轉(zhuǎn)錄因子NF—KB與AP一1的DNA結(jié)合活性有顯著抑制作用，而PKA、PKC與p38MAPK抑制劑則明顯下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CREB的活性。上述

13、結(jié)果表明，AII以劑量依賴依賴方式上調(diào)HK一2細(xì)胞中TSPI基因啟動子活性，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TSPI表達(dá)。PKA、PKC及MAPK途徑的ERK通路和P38MAPK通路可影響AII的這一調(diào)控作用。 總之，通過本研究可得到以下四條結(jié)論：1、腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展過程中．TSPl表達(dá)顯著上調(diào)，其改變程度與腎功能損害密切相關(guān)；拮抗AII能減少TSPl和TGF-β1在纖維化腎組織中的表達(dá)，從而進(jìn)一步對細(xì)胞外基質(zhì)的沉積進(jìn)行調(diào)節(jié)。2、TSPI肽

14、抑制物體外能有效通過競爭抑制TSPI致HK-2細(xì)胞的TGF-β1活化作用，并可相應(yīng)下調(diào)致纖維化相關(guān)成分FN和PAI-l的合成分泌。3、TSPI是TGF-β1重要的內(nèi)源性活化因子，針對TSPI的RNA干擾能在體外有效抑制TSPI表達(dá)并相應(yīng)調(diào)抑了TGF-β1的活化。4、AII可上調(diào)HK-2細(xì)胞中TSPI基因啟動子活性，主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TSPl表達(dá)。PKA、PKC及MAPK途徑的ERK通路和p38MAPK通路可影響AI工的這一調(diào)控作用。因此