雷帕霉素對(duì)UUO大鼠細(xì)胞自噬及腎小管間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、目的:腎小管間質(zhì)纖維化是由各種慢性進(jìn)展性腎臟疾病不可避免的最終結(jié)局。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，此過程涉及腎小管間質(zhì)的損傷，炎性細(xì)胞的浸潤，多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，纖維母細(xì)胞的增殖，細(xì)胞外基質(zhì)積聚等過程，多種細(xì)胞因子參與其中。
　　最近幾年里，自噬在腎臟中的作用逐漸為人們所關(guān)注，一系列研究表明，自噬與多種腎臟疾病相關(guān)。既往研究顯示，自噬功能增強(qiáng)通常對(duì)腎臟功能保護(hù)有益，然而，在某些情形下，過度的自噬可能造成細(xì)胞凋亡或死亡。近年來對(duì)腎

2、臟有關(guān)自噬方面的研究多集中腎小球上皮細(xì)胞、腎臟系膜細(xì)胞方面，對(duì)于腎小管細(xì)胞的研究多限于缺血-再灌注損傷、藥物性腎損害，而對(duì)于梗阻性腎病與自噬的相關(guān)研究較少。
　　目前普遍認(rèn)為，自噬的誘導(dǎo)由哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)所調(diào)控，mTOR是一種非典型的絲氨酸激酶，在進(jìn)化上十分保守，廣泛存在于各種哺乳動(dòng)物中，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長以及自噬。當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)充足或缺少應(yīng)激信號(hào)的狀態(tài)時(shí)，mTOR激活，自噬受到抑制。然而，一旦處于營養(yǎng)缺乏或者

3、是應(yīng)激狀態(tài)，mTOR活性下降或受到抑制，自噬進(jìn)程啟動(dòng)。細(xì)胞饑餓時(shí)誘導(dǎo)自噬的目的在于降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，最終獲得氨基酸再度為細(xì)胞供應(yīng)新的能量來源。
　　當(dāng)mTOR活性下降時(shí)，自噬相關(guān)蛋白(Atg)13去磷酸化，允許其與另一個(gè)Atg形成活化聚合物Atg1。該聚合物啟動(dòng)了自噬體膜的形成，然后自噬體膜延伸包裹待降解的內(nèi)容物。該膜的延展包括了多種Atg蛋白，其中最重要的是蛋白輕鏈(LC)3，LC3表達(dá)水平被普遍地用作自噬標(biāo)記物，廣泛地應(yīng)用于免

4、疫組化等實(shí)驗(yàn)方法中。
　　轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor, TGF-β1)被認(rèn)為是腎小管間質(zhì)纖維化病理進(jìn)程中的一個(gè)中心媒介。它可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成份大量生成，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和趨化活動(dòng)，介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以及導(dǎo)致腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展至終末期腎衰竭。
　　雷帕霉素，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mT

5、OR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑，是一種由鏈球菌屬產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗免疫抗生素，目前主要應(yīng)用于移植后抗排異反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)在抑制腎間質(zhì)纖維化方面有所成效，這可能與自噬有關(guān)。但目前尚未有研究證明雷帕霉素對(duì)梗阻性腎損傷中細(xì)胞自噬有何種程度的影響，梗阻后自噬水平與時(shí)間的變化有著何種關(guān)聯(lián)，以及其與腎臟纖維化之間的關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)SD大鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethralobstruction，UUO)模型，

6、應(yīng)用雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)，結(jié)合免疫組織化學(xué)等手段，觀察不同實(shí)驗(yàn)組中，TGF-β1、LC3、mTOR表達(dá)隨時(shí)間所發(fā)生的變化，探討雷帕霉素對(duì)腎間質(zhì)纖維化的潛在保護(hù)作用，探索腎間質(zhì)纖維化治療的新靶點(diǎn)，為腎間質(zhì)纖維化的臨床防治探索新的可能方向。
　　方法:健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重（180±20）克，54只，經(jīng)過1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，進(jìn)行隨機(jī)分組如下:1、對(duì)照組（A組）;2、UUO模型組（B組）;3、雷帕霉素治療組（C組）;每組各18只。分

7、別于術(shù)后第3、7、14天隨機(jī)選取6只大鼠取出其梗阻側(cè)腎臟組織，分別為D3、D7、D14組，每組各6只。手術(shù)過程:B、C組大鼠給予10％水合氯醛（0.1 ml/kg）腹腔注射+2％鹽酸利多卡因皮下麻醉。備皮消毒鋪單后，給予左側(cè)腹部縱形切口，暴露左腎下極后，沿之尋找左側(cè)輸尿管，在左側(cè)輸尿管中上1/3交界處的上下2處分別用絲線結(jié)扎，并從中上1/3交界處剪斷，以避免逆行感染;而A組除了不結(jié)扎、剪斷輸尿管外，其余過程與B、C二組相同。給藥:從手術(shù)

8、前1天開始，給予各組大鼠每天灌胃1次，每周復(fù)查體重，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量;治療組以雷帕霉素2 mg/kg/d劑量灌胃;A組及B組以等容的0.9％NaCl溶液替代雷帕霉素溶液灌胃。實(shí)驗(yàn)期間不限制食水。術(shù)后第3天、7天、14天，分別從A、B、C組中隨機(jī)選取6只大鼠取出梗阻腎，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋。之后HE染色、Masson染色，以觀察各組大鼠梗阻腎組織病理變化，并采用免疫組織化學(xué)方法測定TGF-β1、mTOR及LC3表達(dá)水平，應(yīng)用圖

9、像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， P＜0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:光鏡下HE染色:A組，未見明顯異常;B組，在術(shù)后第3天，可見少量炎癥細(xì)胞在腎間質(zhì)局部浸潤，腎小管有輕度擴(kuò)張;第7天，可見腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)寬度明顯增加，腎小管明顯擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死;第14天，可見較多腎小管

10、萎縮，腎小管基底膜有彌漫性增厚、皺縮;C組，術(shù)后腎小管間質(zhì)病變隨梗阻時(shí)間延長進(jìn)行性加重，其程度較同時(shí)相B組的病變程度輕，但仍明顯重于A組。Masson染色:A組，未見明顯異常;B組，在術(shù)后第3天可見腎小管有輕度擴(kuò)張，膠原纖維較A組有所增加;術(shù)后第7天及第14天，腎小管擴(kuò)張程度進(jìn)行性加重，膠原纖維顯著增多，間質(zhì)纖維化現(xiàn)象明顯;C組，術(shù)后腎小管擴(kuò)張程度、膠原纖維表達(dá)水平隨梗阻時(shí)間延長進(jìn)行性加重、增多，其較同時(shí)相B組的病變程度稍輕，但仍明顯終

11、于A組。免疫組織化學(xué)結(jié)果:(1)TGF-β1: A組，腎小管上皮細(xì)胞中可見少量表達(dá); B組，腎小管上皮細(xì)胞中可見表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間的延長，其表達(dá)水平呈進(jìn)行性升高，且與A組同時(shí)相相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）; C組，TGF-β1的表達(dá)水平與同期B組表達(dá)水平相比較均有顯著下降（P＜0.05），但仍高于同期A組中（P＜0.05）的表達(dá)水平。(2) LC3:A組，存在基礎(chǔ)水平表達(dá); B組，第3天時(shí)腎小管上皮細(xì)胞中出現(xiàn)廣泛水平的表達(dá)，較A

12、組顯著增加（P＜0.05），第7天時(shí)，其表達(dá)水平較第3天有所下降（P＜0.05），第14天，其表達(dá)水平下降接近至基礎(chǔ)水平;C組，第3天時(shí)腎小管上皮細(xì)胞中出現(xiàn)廣泛水平的表達(dá)，且較同時(shí)期B組表達(dá)水平增高（P＜0.05），第7天時(shí)有所下降，但仍高于同時(shí)期B組之表達(dá)水平（P＜0.05），第14天時(shí)進(jìn)一步下降，表達(dá)水平仍高于同時(shí)期B組（P＜0.05）。(3) mTOR:A組，在腎小管上皮細(xì)胞中有一定水平的表達(dá);B組，第3天時(shí)，表達(dá)水平較A組顯著下

13、降（P＜0.05），第7天時(shí)表達(dá)水平較第3天升高（P＜0.05），第14天時(shí)其表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P＜0.05);C組，第3天時(shí)，其表達(dá)水平較A組顯著下降（P＜0.05），較B組同期有所下降，第7、14天時(shí)表達(dá)水平較第3天時(shí)上升（P＜0.05），且隨著梗阻時(shí)間延長進(jìn)行性增高;同時(shí)相表達(dá)水平較B組同期下降。
　　結(jié)論:(1)梗阻早期腎小管上皮細(xì)胞自噬水平顯著增加，晚期顯著減少，mTOR表達(dá)趨勢(shì)與之相反。提示梗阻早期腎小管細(xì)胞受到輕度