雷帕霉素對腹膜纖維化的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　腹膜纖維化迄今仍然是一個世界性的難題，是導致尿毒癥患者被迫中斷長期腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)的最主要因素，目前尚無有效的治療方法。在非生理性腹膜透析液的長期刺激下，就會導致腹膜纖維化的發(fā)生，其重要機理是腹膜間皮細胞從上皮細胞表型向肌纖維母細胞的轉分化，即上皮間質轉化(epithelialmesenchymal transition，EMT)過程的發(fā)生，由此啟動細胞增殖和膠原等基質的積聚

2、等，主要信號轉導涉及到TGF-β-Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR途徑等。雷帕霉素（rapamycin），通過與FK結合蛋白(FK-binding protein，FKBP)結合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，進而抑制細胞生長與增殖。在腎、肝、心等多個臟器領域的研究中雷帕霉素在抗增殖和抗纖維化方面已經顯示了重要作用。而雷帕霉素在防治腹膜纖維化方面的報道

3、非常少且機制仍未闡明。
　　Rho GTPases作為Ras超家族的一個亞族，通過調節(jié)細胞骨架的重構及基因轉錄，調控了大量如細胞極化、細胞的黏附及遷移、分化、增殖等的細胞活動。其中研究的最多的三個成員是RhoA、Rac1和Cdc42。研究表明，Rho GTPases在EMT過程中起到了至關重要的作用。此外，研究證實，mTOR與Rho GTPases之間的信號交互作用，參與介導了多種細胞EMT及纖維化病變的發(fā)生過程;而雷帕霉素通過阻

4、斷mTOR的表達抑制部分Rho GTPase的活性，進而抑制EMT。目前mTOR與Rho GTPases在腹膜纖維化中作用的研究尚未見報道?；谝陨戏治?，我們認為雷帕霉素可能通過調節(jié)Rho GTPases的活性抑制腹膜間皮細胞EMT及腹膜纖維化的過程。為此，本研究開展如下。
　　第一部分 雷帕霉素有效抑制腹膜透析大鼠腹膜纖維化
　　研究目的:
　　明確雷帕霉素對于腹膜透析模型大鼠腹膜纖維化的防治效果
　　實驗方

5、法:
　　取45只正常SD大鼠，隨機分為5組:正常組，生理鹽水組，高糖組，低濃度雷帕治療組，高濃度雷帕治療組，處理6周后處死，評估腹膜功能，取腹膜組織，行HE染色及α-肌動蛋白(smooth muscle actin-alpha,α-SMA)及轉化生長因子-β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)的免疫組化染色，分析各組腹膜纖維化情況， Western Blot及realtime PCR檢測α

6、-SMA、TGF-β1的表達變化。
　　結果:
　　高糖組大鼠的腹膜功能相較正常組及生理鹽水組明顯下降，低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜功能; HE染色顯示，高糖組呈現腹膜纖維化狀態(tài)，腹膜厚度明顯增加，低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜纖維化狀態(tài)，且呈濃度相關性。免疫組化、Western Blot及realtime PCR顯示，高塘組α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表達較對照組明顯升高，雷帕組表達明顯下降，且呈濃

7、度相關性。
　　結論:
　　通過動物層面驗證了雷帕霉素對腹膜纖維化有明顯的防治作用，在有效濃度范圍內，其防治效果與劑量呈一定的正相關。雷帕霉素減少TGF-β的分泌，抑制成纖維細胞的形成，抑制細胞外基質形成。
　　第二部分 雷帕霉素抑制高糖誘導腹膜間皮細胞EMT的研究
　　研究目的:
　　明確雷帕霉素對于腹膜間皮細胞EMT的抑制作用
　　實驗方法:
　　取正常SD大鼠腹膜，原代培養(yǎng)腹膜間皮細胞，

8、取第3-4代細胞，予以不同濃度高糖(30，60，120mM)干預，及不同濃度雷帕霉素(10，100nM)干預一定時間，通過Western Blot檢測細胞中α-SMA及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達，通過realtime PCR檢測α-SMA、纖維連接蛋白（Fibronectin）及膠原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)的表達;細胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測細胞遷移能力的變化。
　　結果:
　　高糖處理后，

9、α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達量相較正常組明顯升高，E-cadherin的表達量明顯下降，細胞遷移能力明顯增加。與高塘組相比，雷帕霉素使α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達明顯下降，E-cadherin的表達明顯升高，細胞遷移能力明顯下降，且呈濃度相關性。
　　結論:
　　高糖處理后腹膜間皮細胞呈現EMT改變，雷帕霉素有效抑制高糖誘導的腹膜間皮細胞EMT。
　　第三

10、部分 雷帕霉素通過抑制Rho GTPases的活性逆轉腹膜間皮細胞EMT
　　研究目的:
　　探索雷帕霉素抑制腹膜間皮細胞EMT的具體作用機制
　　實驗方法:
　　取原代培養(yǎng)腹膜間皮細胞，予以不同濃度高糖(30，60，120mM)干預，及不同濃度雷帕霉素(10，100nM)干預一定時間，通過Western Blot檢測細胞中磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-4，5-bisphosph

11、ate3-kinase，PI3K）的、p-PI3K、蛋白激酶B（PKB或Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達;通過pull down方法檢測GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白的表達;通過細胞免疫熒光方法觀察細胞骨架的變化情況。
　　結果:
　　高糖處理后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達量相較正常組明顯升高，雷帕霉素明顯減少p-mTOR的表達量;Pull down實驗顯示，R

12、hoA、Rac1及Cdc42的GTP活化水平在高糖刺激后明顯升高，雷帕霉素使三者的GTP水平明顯下降;細胞免疫熒光實驗顯示，正常的腹膜間皮細胞呈現少量的應力纖維（stress fiber）、粘著斑(focal adhesion)、板狀偽足（lamellipodia）、絲狀偽足(filopodia)，高糖刺激使得腹膜間皮細胞形成更多的stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia，而雷